A complete and automated end-to-end sample preparation strategy for high-throughput and standardized proteomics with high sensitivity

Význam tématu

Vysokopropustná a standardizovaná příprava vzorků je klíčová pro konzistentní a citlivou proteomiku. Automatizace minimalizuje lidské chyby, zkracuje dobu zpracování a umožňuje zpracování stovek až tisíců vzorků s nízkou variabilitou.

Cíle a přehled studie

Studie představuje kompletní a plně automatizovanou strategii přípravy vzorků, která pokrývá všechny kroky od agregace proteinu až po naložení peptidů na Evotip. Cílem bylo dosáhnout vysoké citlivosti, robustní reprodukovatelnosti a škálovatelnosti od 1 do 96 vzorků na instrumentaci Evotip Pure a LC-MS systémech.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Proteinová agregace zachycením (PAC) na magnetických hydroxyl mikročástečkách (Resyn Biosciences).
• Digestion mix: poměr Lys-C 1:100 a trypsin 1:25, inkubace při 37 °C po dobu 30 min až 16 h.
• Automatické vrstvení kapalin a přímé naložení peptidů na Evotip Pure pomocí Agilent AssayMAP Bravo (VWorks v13).

Instrumentace:

• Evotip Pure (Evosep Biosystems).
• Agilent AssayMAP Bravo s 96 sondami.
• LC-MS systémy: timsTOF Pro 2 (Bruker) s dia-PASEF, timsTOF HT s Whisper Zoom 40 a 80 SPD.
• Triple quadrupole QQQ 6495C (Agilent) pro cílenou analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Digestion efficiency: 67 % po 30 min a 89 % při přenocování.
• Reprodukovatelnost: CV proteomických dat <15 % u všech časových bodů, <7 % pro 1 000 ng vstupu.
• Senzitivita: identifikace >90 000 prekurzorů a >8 000 proteinů z 1 000 ng HeLa lysátu metodou Whisper Zoom 40 SPD, při 80 SPD ~70 000 prekurzorů a >7 200 proteinů.
• Lineární kvantifikace napříč rozsahem vstupních množství (5–1 000 ng) s R² >0,96.
• Provozní výkon: zpracování až 480 vzorků za 24 h (500 SPD režim) s variabilitou CV <7 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost a krátké doby analýzy umožňují škálování projektů.
• Minimální spotřeba enzymů a vzorku s úsporou nákladů.
• Snížení manuální práce a rizika kontaminace.
• Flexibilní nastavení parametrů (počet vzorků, doba digestu, procento naložení peptidů).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s umělou inteligencí pro optimalizaci parametrů a vyhodnocení dat v reálném čase.
• Rozšíření do single-cell proteomiky a analýzy vzácných vzorků.
• Další zrychlení analytických metod a zlepšení pokrytí proteomu.
• Vývoj nových sorbentů a modulárních platforem pro citlivější a cílené aplikace.

Závěr

Navržená plně automatizovaná strategie spojuje efektivní přípravu vzorků, flexibilitu nastavení a vysokou citlivost v rámci jednoho workflow. Umožňuje rychlé, opakovatelné a nákladově efektivní zpracování stovek vzorků denně s důrazem na kvalitu dat.