QUANTITATIVE MEASUREMENT OF DRIED BLOOD SPOT GUANIDINOACETATE AND CREATINE FOR CLINICAL RESEARCH

Význam tématu

Guanidinoacetát a kreatin jsou klíčové biomarkery při screeningu novorozenecké GAMT (guanidinoacetát methyltransferáza) deficience, která vede k cerebrální nedostatečnosti kreatinu. Kvantitativní analýza těchto látek v sušených krevních sklíčkách umožňuje včasné odhalení metabolických poruch, včasnou léčbu a prevenci neurologických komplikací.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit neodvozovanou metodiku pro simultánní měření GUAC a CRE ve standardních sušených krevních sklíčkách pomocí systému Waters FIA-MS/MS. Studie porovnávala linearitu, přesnost a shodu výsledků s referenčními materiály CDC za účelem posouzení vhodnosti metody pro výzkum a screening.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava DBS: hematokrit upravený pro cílové koncentrace L1–L9, nanesení na Whatman 903, sušení a skladování při –20 °C.
• Extrahování: 3,2 mm punč do 96-well destičky, inkubace s interními standardy (GUAC-d2, CRE-15N3) v roztocích MeOH/H2O/formamidové kyseliny.
• Analýza: přímý vstřik 10 µl extraktu do FIA-MS/MS, ESI pozitivní režim, MRM přechody GUAC 118,1>76; CRE 132,1>90.

Instrumentace:

• Waters MassTrak ACQUITY UPLC I-Class PLUS s FL Sample Manager
• Xevo TQD Mass Spectrometer
• Software: Analyse-IT pro Microsoft Excel

Hlavní výsledky a diskuse

Linearita a přesnost:

• Lineární rozsah L1–L9: koeficient determinace r2 ≥ 0,99 pro GUAC i CRE.
• Impreciznost všech hladin < 20 % podle CLSI EP06-ED2:2020.
• Průměrné výtěžnosti: GUAC 108 %, CRE 91 %.

Porovnání s CDC materiály:

• Přesnost vs. CDC: GUAC ~96 %, CRE ~105 %.
• Impreciznost na úrovni < 20 % (4 replikáty).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přímá analýza bez derivatizace s minimem manipulace.
• Vysoká spolehlivost a shoda s referenčními hodnotami CDC.
• Možnost rozšíření panelu pro další metabolity v rámci multi-tier screeningu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Postupný rozvoj multimarkerových screeningů novorozeneckých vzorků s využitím á la carte metodik na moderních hmotnostních spektrometrech. Integrace automatizace přípravy vzorků, vyhodnocovacích softwarů a databází pro rychlejší interpretaci výsledků. Rozšíření na monitorování farmakoterapie a terapeutického sledování pacientů s narušenou biosyntézou kreatinu.

Závěr

Předložená neodvozovaná FIA-MS/MS metoda pro kvantifikaci guanidinoacetátu a kreatinu v sušených krevních sklíčkách prokázala vysokou linearitu, přesnost a shodu s referenčními CDC materiály. Díky jednoduché přípravě vzorku a použití jednoho analytického běhu představuje efektivní řešení pro klinický výzkum a screening novorozeneckých metabolických poruch.

Reference

1. Baby’s First Test. Conditions/Guanidinoacetate Methyltransferase Deficiency. 2022.
2. Kilgore J. et al. Development of a Universal Second-Tier Newborn Screening LC-MS/MS Method for Amino Acids, Lysophosphatidylcholines, and Organic Acids. Analytical Chemistry. 2023;95(6):3187–3194.