General workflow for untargeted plasma lipidomics on Orbitrap mass spectrometers

Význam tématu

Lipidomika poskytuje cenné informace o stavech buněčného metabolismu a patofyziologii řady onemocnění, včetně rakoviny a diabetu.
Detekce specifických lipidových biomarkerů umožňuje včasnou diagnostiku, monitorování terapie a vývoj personalizované medicíny.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je představit optimalizovaný postup pro neřízenou (untargeted) analýzu lipidů v lidské plasmě pomocí UHPLC a vysoké rozlišovací schopnosti Orbitrap hmotnostních spektrometrů.
Popisuje extrakci lipidů, chromatografické podmínky, instrumentaci, datové akviziční workflow AcquireX a příklady identifikace lipidu na úrovni MS2/MSn.

Použitá instrumentace

• UHPLC Vanquish Horizon se C30 kolonou Accucore (2,1×150 mm, 2,6 µm)
• Orbitrap Exploris 120 a 240 pro full scan MS a MS2 (rezoluce až 120 000)
• Orbitrap IQ-X Tribrid pro multi-stupňovou fragmentaci (MSn) s HCD a CID
• AcquireX inteligentní akviziční workflow pro automatické vylučování pozadí
• Softwary Compound Discoverer 3.3 a LipidSearch 5.1 pro zpracování dat

Použitá metodika

1. Extrakce lipidů: přidání deuterovaných standardů, ukončení proteinů methanolem a chloroformem, fáze oddělení, sušení a resuspendace v acetonitril:isopropanol 1:1.
2. Chromatografie: gradientní eluce na C30 kolonu, teplota kolony 45 °C, autosampler 15 °C, mobilní fáze s 10 mM ammonium formiátu a 0,1 % kyseliny formiové.
3. Datová akvizice: full scan MS (m/z 200–1700) s Easy-IC kalibrací, rozhraní H-ESI s polaritním přepínáním, datově závislé MS2 s top-4 nebo časovým cyklem 1,5 s.
4. Workflow AcquireX: postupné vylučování nebiologických a opakujících se iontů, iterativní fragmentace dosud neanalyzovaných signálů (5 injekcí pro plasmové vzorky).
5. Multi-stadia na IQ-X: podmíněná CID MS2 a MS3 aktivace při detekci diagnostických fragmentů (např. m/z 184 pro PC) pro rozlišení izomerů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Accucore C30 kolona umožnila lepší rozlišení isomerických lipidů než běžné C18.
• AcquireX zvýšil počet identifikovaných lipidů až o 50 % oproti běžnému DDA.
• Polaritní přepínání pozitivní/negativní módu přineslo o 21 % více lipidových molekul.
• Multi-stupňová fragmentace (MSn) na IQ-X poskytla jednoznačné výpovědi o poloze a typu mastných acylů u koelujících TG isomerů.
• Přidání deuterovaných interních standardů a QC pool vzorků zachytilo hmotnostní drift, chromatografické posuny i variabilitu extrakce.

Přínosy a praktické využití metody

Propojení UHPLC C30 a Orbitrap technologie přináší vysokou citlivost, přesnou hmotnost a vynikající separaci komplexního lipidového profilu.
AcquireX zefektivňuje sběr MS2/MSn dat a eliminuje pozadí, což vede ke kvalitním a kvantitativně spolehlivým analýzám pro výzkum a QA/QC v biomedicíně a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj inteligentních akvizičních algoritmů s umělou inteligencí pro real-time rozhodování o fragmentaci.
Integrace iontové mobilní spektrometrie a širší nasazení lipidomiky v klinických laboratořích přispěje k přesnějším diagnostickým profilům.
Datové platformy umožní hlubší multiomické analýzy a personalizované sledování metabolických změn.

Závěr

Popisovaný workflow kombinuje optimalizovanou extrakci, UHPLC C30 separaci, vysokou rozlišovací schopnost Orbitrap MS a inteligentní AcquireX akvizici.
Multi-stupňová fragmentace na Tribrid přístroji poskytuje vysokou šíři a hloubku lipidových profilů s jednoznačnými strukturálními informacemi.

Reference

• 1. Bashar A. et al. Quality assurance and quality control in metabolomics: achieving high-quality data for high-quality results. Thermo Scientific Application Note 001771.
• 2. Hackbusch S. et al. Reproducible measurement and confident identification of the plasma lipidome from obese mice using the Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer. Thermo Scientific Application Note 000696.
• 3. Narváez-Rivas M., Zhang Q. Comprehensive untargeted lipidomic analysis using core-shell C30 particle column and high field orbitrap mass spectrometer. J Chromatogr A. 2016;1440:123–134.