Quantitation of N-nitrosamines in dietary supplement by using LC-MS/MS

Význam tématu

Proteiny ve formě prášků jsou populární výživový doplněk, ale mohou být kontaminovány vysoce potentními mutagenními a karcinogenními N-nitrosaminy. Tyto nebezpečné sloučeniny vznikají v důsledku reakce sekundárních či terciárních aminů s nitritovými nečistotami. S ohledem na vysoké denní dávky proteinových doplňků je jejich pravidelné sledování klíčové pro ochranu zdraví spotřebitelů.

Cíle a přehled studie

Studie představuje rychlou, jednoduchou a přesnou metodu pro kvantifikaci čtyř vybraných N-nitrosaminů (NDMA, NEIPA, NDPA, NDIPA) v prášcích proteinových doplňků. Cílem bylo rozvinout a validovat extrakci vzorku a následnou LC-MS/MS analýzu s vysokou citlivostí pro nízké úrovně (0,1–5,0 ppb).

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku zahrnoval:

• Odběr 0,4 g proteinového prášku a přípravu suspenze ve vodě
• Liquid-liquid extrakci s organickým extrakčním činidlem za přidání salta
• Centrifugaci, filtraci prostřednictvím 0,45 µm nylonového filtru a přímou injekci

Instrumentace:

• UHPLC Nexera X3 se sloupcem Shim-pack Scepter C8-120 (3,0×150 mm, 5 µm)
• Mobile phase: A) 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě, B) 0,1 % kyseliny mravenčí v methanolu
• Gradientní eluce (10–95–10 % B) při 0,5 mL/min, teplota kolony 40 °C
• Detekce na LCMS-8060NX triple kvadruple s APCI rozhraním; nastavení DL 180 °C, blok 200 °C, APCI 300 °C
• MRM přechody: NDMA 75.3>58.3, NEIPA 117.0>75.1, NDPA 131.0>89.05, NDIPA 131.0>42.9

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární kalibrace ve zvoleném rozsahu 0,1–5,0 ppb pro všechny analyty vykázala koeficienty R² nad 0,988. Zjištěná přesnost spíkování (recovery) se pohybovala mezi 70 a 120 % podle SANTE/12682/2019. Reprodukovatelnost (RSDr) byla lepší než 20 % pro všechna činidla. Tyto parametry potvrzují spolehlivost metody pro stanovení ultra stopových hladin N-nitrosaminů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou selektivitu a specifitu detekce díky MRM režimu
• Rychlý proces přípravy vzorku s minimem kroků
• Možnost vyhodnocení více N-nitrosaminů ve jedné analýze
• Vhodnost pro rutinní kontroly kvality a bezpečnosti v potravinářském a farmaceutickém průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciál dalšího rozvoje:

• Automatizace extrakce a integrace s 96-well platformami
• Rozšíření spektra analyzovatelných N-nitrosaminů
• Využití ultracitlivých detektorů pro sub-ppb analýzy
• Adaptace metody pro různé matrice (tekutiny, pevné vzorky)

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda s likvidně-likvidní extrakcí a APCI detekcí umožňuje spolehlivé kvantitativní stanovení čtyř vybraných N-nitrosaminů v proteinových prášcích na úrovních ppb. Dosahuje požadavků na linearitu, přesnost i reprodukovatelnost dle mezinárodních SANTE směrnic.

Reference

1. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues and analysis in food and feed. SANTE/11312/2021.
2. WHO information note: Nitrosamine impurities. 2019.
3. The hidden dangers of protein powders. Harvard Health Publishing.