Sub-Picogram Level Bio-Analytical Method for Quantification of Desmopressin in Human Plasma Using LCMS-8060NX

Význam tématu

Desmopresin je syntetický peptidový analog antidiuretického hormonu vasopresinu, široce využívaný v léčbě poruch diurézy a u biofarmaceutických studií. Přesné stanovení jeho koncentrací v lidské plazmě na sub-pikogramové úrovni je zásadní pro farmakokinetické studie, bioekvivalenční testy a terapeutický monitoring, kde i malé odchylky měření mohou ovlivnit regulační rozhodování.

Cíle a přehled studie

Cílem publikované aplikace bylo vyvinout a částečně validovat vysoce citlivou kvantitativní metodu pro detekci desmopresinu v lidské plazmě s dolní mezí kvantifikace (LLOQ) 0,25 pg/mL využitím LCMS-8060NX. Studie demonstruje robustnost, reprodukovatelnost a snadnou přenositelnost mezi laboratořemi.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci vzorků byla zavedena jednoduchá jednorázová metoda pevné fáze (SPE) s následujícími kroky:

• přidání extrakčního pufru do plasmy a vortexování,
• nastřádání na C18 SPE kolony (podmínění methanolem a vodou),
• dvousložkové promývání a eluční krok organickým rozpouštědlem,
• odpaření eluátu pod dusíkem při 50 °C a rekonstituce ve 100 µL roztoku 1 mM formiátu amonného:methanol (70:30).

Chromatografické oddělení proběhlo na columně Shim-pack GIST-HP C18-AQ (1,9 µm, 50 × 2,1 mm) s gradientním elučním režimem. Detekce byla realizována v režimu MRM pod pozitivní ESI na triple kvadrupólovém spektrometru Shimadzu LCMS-8060NX.

Použitá instrumentace

• Shimadzu Nexera X2 s LCMS-8060NX triple kvadrupól
• Shim-pack GIST-HP C18-AQ kolona (50 × 2,1 mm, 1,9 µm)
• SPE C18 kazety pro extrakci vzorků
• ESI zdroj s IonFocus a UF-QarrayTM technologií

Hlavní výsledky a diskuse

Validace metody podle FDA ukázala:

• Lineární rozsah 0,25–40 pg/mL s vážením 1/x2 (r > 0,99).
• Intradení a mezidení přesnost (%RSD) pod 15 % pro QC úrovně a pod 20 % pro LLOQ.
• Accuracy v rozmezí 98–117 % nominálních hodnot.
• Obnova analyta kolem 76,7 % se střední precizností 4,8 %.
• Matrix-efekt nižší než 12 % na všech QC úrovních, bez významných interferencí.
• Žádný carry-over po injekci vysokého kalibračního standardu.

Metoda prokázala vynikající citlivost, selektivitu a opakovatelnost vhodnou pro farmakokinetické a bioekvivalenční studie desmopresinu.

Přínosy a praktické využití

Osvědčená technika nabízí:

• extrémně nízké požadované množství plazmy,
• jednostupňovou a rychlou přípravu vzorku s vysokou produktivitou,
• vysokou přenositelnost mezi laboratořemi,
• možnost aplikace v rutinní analýze, PK/PD studiích a bioekvivalenci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se bude zaměřovat na automatizaci SPE, rozšíření analýzy na další peptidy a proteiny, využití nových ionizačních zdrojů pro zlepšení citlivosti a integraci s vysoce propustnými platformami pro klinický výzkum.

Závěr

Vyvinutá a částečně validovaná LC-MS/MS metoda poskytuje spolehlivé a reprodukovatelné stanovení desmopresinu v lidské plazmě na sub-pikogramové úrovni. Metoda splňuje regulační požadavky a je vhodná pro farmakokinetické, bioekvivalenční i rutinní studie.

Reference

1. Wishart DS a kol. DrugBank 5.0: update on DrugBank database. Nucleic Acids Res. 2018;46(D1):D1074–D1082.
2. FDA. Desmopressin acetate oral tablet bioequivalence protocol. 2020.
3. FDA. Bioanalytical method validation guidance for industry. 2018.