Optimizing Adeno-Associated Virus Loading Amounts for Host Cell Protein Analysis

Význam tématu

Hostitelské proteiny (HCP) jsou vedlejší produkty buněčné kultivace, jež mohou negativně ovlivnit stabilitu a bezpečnost bioterapeutik. V případě genové terapie s adeno-asociovanými viry (AAV) je nízký výtěžek produkce výzvou pro analýzu HCP pomocí LC/MS, kde je nutné vnést vysoké množství vzorku k dosažení citlivosti. Tato problematika má významný dopad na validaci a kvalitu finálních produktů v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo nalézt kompromis mezi množstvím AAV vzorku v nanesení na kolonu a schopností detekovat nízkoúrovňové hostitelské proteiny. Autoři porovnali tři hustoty naložení odpovídající 50 %, 33 % a 12,5 % původní koncentrace (4,75×10¹² VP/mL) a sledovali počet identifikovaných HCP a jejich detekční limity.

Použitá instrumentace

Pro chromatografii a hmotnostní spektrometrii bylo použito následující vybavení:

• Agilent 1290 Infinity II LC (pumpa G7120A, multisampler G7167B, termostat G7116B)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s duálním Agilent Jet Stream zdrojem

Reagentní sestava:

• AAV1 empty reference standards (Charles River Labs)
• Promega Lys-C/trypsin mix, MilliporeSigma činidla
• Mobilní fáze: voda a acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí

Analytický software: Agilent MassHunter 10.1, Byos (Protein Metrics).

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala, že největší množství vzorku (50 %) umožnilo detekci nejvyššího počtu HCP zapadajícího až do úrovně 300 ppb. Při 33 % bylo možné zachytit proteiny do 500 ppb, zatímco při 12,5 % žádný z HCP nesplnil kvalifikační kritéria. Dynamický rozsah systému přesahuje pět řádů, což umožnilo kvalitní identifikaci i velmi nízkoabundantních peptidů s chybou hmotnostního určení <1 ppm a stoprocentním pokrytím sekvence.

Detekované HCP (50 % naložení) zahrnovaly zejména proteiny typu zinkových prstů, kinázy a myosinů v koncentracích 0,3–22,7 ppm. Díky ostrým chromatografickým píkům s faktorům ohonu okolo 1,08 nebyla narušena rozlišitelnost koelujících peptidů kapsidových proteinů a HCP.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený workflow kombinuje kolonu AdvanceBio Peptide Plus odolnou vůči vysokému zatížení se systémem 6545XT LC/Q-TOF, čímž nabízí vysokou citlivost i pro vzorky s omezeným objemem. Metoda umožňuje kvantifikaci HCP do subppm oblasti, což napomáhá plnění regulatorních požadavků a zajišťuje kvalitu finálních AAV přípravků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metodiky lze směřovat k automatizaci iterativních MS/MS běhů pro zvýšení identifikace ultra-nízkých HCP. Integrace vysoce výkonných software nástrojů pro datovou analýzu a uplatnění nových ionizačních technik by mohly dále rozšířit dynamický rozsah a přispět k širšímu nasazení v průmyslové výrobě genových terapií.

Závěr

Studie prokázala, že optimální množství AAV pro LC/MS analýzu HCP leží mezi 33–50 % původního titru, což umožňuje zachytit nízké úrovně kontaminantů pod hranicí 1 ppm. Navržené platformy a workflow jsou vhodné pro validaci kritických atributů kvality u vzorků s omezeným objemem.

Reference

1. FDA. Human Gene Therapy for Neurodegenerative Diseases guidance, 2023.
2. Jones M. et al. High-risk Host Cell Proteins (HCPs): A Multi-company Collaborative View. Biotechnol. Bioeng. 2021, 118, 2870–2885.
3. Wu L.; Wu S.; Chu W. Host Cell Protein Analysis Using Agilent AssayMAP Bravo and 6545XT LC/Q-TOF, Agilent 5991-9300EN.
4. Huang Y. et al. Toward Unbiased Identification of Host Cell Protein Impurities by Automated Iterative LC–MS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2021, 200, 114069.
5. Pilely K. et al. Monitoring Process-Related Impurities in Biologics– HCP Analysis. Anal. Bioanal. Chem. 2022, 414, 747–758.
6. Rumachik N.G. et al. Methods Matter: Standard Production Platforms for Recombinant AAV. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2020, 18, 98–118.