ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA KLINICKÝCH VZORKŮ – CESTA K TRANSLAČNÍMU VÝZKUMU

Význam tématu

Elektrochemická detekce biomolekul, zejména DNA a RNA nádorových biomarkerů, představuje perspektivní alternativu k tradičním optickým metodám. Díky nižší ceně přístrojového vybavení, vyšší rychlosti a možnosti práce s menšími objemy vzorků může významně zrychlit a zlevnit diagnostiku v klinické praxi. Včasná a citlivá identifikace nádorových změn na úrovni nukleových kyselin má klíčový dopad na úspěch léčby a sledování progrese onemocnění.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem referátu je shrnout současný stav vývoje elektrochemických metod pro analýzu klinických vzorků s důrazem na isotermální amplifikační techniky (LAMP, RPA, RCA) v kombinaci s elektrochemickou detekcí. Autoři prezentují principy detekce DNA a RNA nádorových biomarkerů, ukazují vlastní výsledky aplikace na klinickém materiálu (HPV, hCMV, miRNA, PCA3) a zdůrazňují význam spolupráce s biobankami pro přístup k reálným vzorkům.

Použitá metodika a instrumentace

Metodický přístup kombinuje izotermální amplifikační techniky s elektrochemickým měřením:

• LAMP: exponenciální izotermální amplifikace s 4–6 primery při 60–65 °C, možnost jedno- nebo dvoustupňové reakce (qLAMP, RT-LAMP)
• RPA: rychlá izotermální amplifikace při 37–42 °C s enzymy rekombinasou a SSDBP
• RCA: tvorba kruhové DNA templátu pomocí ligace padlock sond a následná lineární nebo hyperbranched amplifikace
• Elektrochemická detekce: hybridizace na sondy imobilizované na tištěných uhlíkových nebo zlatých elektrodách, magnetických kuličkách, signál generován peroxidázovou reakcí (HRP/TMB) a měřen amperometricky

Použitá instrumentace

• Termobloky pro izotermální amplifikaci
• Potenciostat pro amperometrická měření (Metrohm a další)
• Tištěné uhlíkové elektrody a pozlacené pracovní elektrody
• Magnetické kuličky se streptavidinem nebo specifickými protilátkami
• Enzymy: DNA/RNA polymerasa, rekombinasa, ligasa, peroxidasa (HRP)
• Chemikálie: digoxigenin-dUTP, biotin-dUTP, TMB, H2O2
• Protilátky: antiDIG, S9.6 (pro hybrid DNA/RNA)

Hlavní výsledky a diskuse

V oblasti DNA biomarkerů autoři demonstrovali elektromechanickou detekci virových genů HPV16 a HPV18 a hCMV přímo z klinických vzorků pomocí LAMP na magnetických kuličkách i přímo na elektrodách. Kombinace izotermální amplifikace a značkovaných nukleotidů umožnila spolehlivou detekci srovnatelnou s PCR. U RNA biomarkerů byly vyvinuty dvě strategie detekce onkogenních miRNA – pomocí hybridizační řetězové reakce (HCR) zachycené protilátkou S9.6 a za použití His-tag zinc finger proteinu. Dále byl optimalizován elektrodový test pro dlouhou nekódující RNA PCA3 z moči pacientů s karcinomem prostaty. Tyto metody byly validovány proti digitální PCR a klinickým datům a prokázaly vysokou citlivost a specificitu.

Přínosy a praktické využití metody

Elektrochemické biosenzory nabízejí rychlé, levné a přenosné řešení pro detekci nukleových kyselin. Jsou schopné pracovat s nízkými objemy vzorků, paralelně analyzovat více vzorků a multiplexovat detekci různých biomarkerů. Díky toleranci k inhibičním látkám obsaženým v klinickém materiálu minimalizují potřebu rozsáhlé předúpravy vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Hlavními směry dalšího rozvoje jsou:

• Další miniaturizace a integrace do point-of-care zařízení
• Multiplexní detekce panelů biomarkerů
• Využití umělé inteligence pro zpracování dat
• Bezprostřední odběr a zpracování klinického materiálu
• Systémová podpora výzkumu prostřednictvím biobank

Závěr

Isotermální amplifikační techniky v kombinaci s elektrochemickou detekcí představují perspektivní cestu pro rychlou a cenově dostupnou diagnostiku nukleových kyselin přímo v klinických vzorcích. Klíčovým krokem k translaci do praxe je ověření metod na reálných klinických vzorcích získaných prostřednictvím sítí biobank, které zajišťují standardizované vzorky a data. Tento přístup může významně přispět k personalizované medicíně a včasnému odhalování nádorových onemocnění.

Reference

• 1. Calzone K. A.: Semin. Oncol. Nurs. 28, 122 (2012).
• 2. Aghabozorgi A. S. et al.: Biochimie 157, 64 (2019).
• 3. Bartosik M., Jirakova L.: Klin. Onkol. 31, 93 (2018).
• 4. Bartosik M., Jirakova L.: Curr. Opin. Electrochem. 14, 96 (2019).
• 5. Bartosik M., Hrstka R., Jirakova L.: Klin. Onkol. 31, 89 (2018).
• 6. Moranova L., Bartosik M.: Klin. Onkol. 32, 65 (2019).
• 7. Aliofkhazraei M. et al.: Comprehensive Materials Processing, Elsevier, Oxford 2014.
• 8. Bodulev O. L., Sakharov I. Y.: Biochemistry 85, 147 (2020).
• 9. Deng H., Gao Z.: Anal. Chim. Acta 853, 30 (2015).
• 10. Bartosik M. et al.: Anal. Chim. Acta 1042, 37 (2018).
• 11. Moranova L. et al.: Talanta 238, 123064 (2022).
• 12. Anton M. et al.: Anal. Methods 12, 822 (2020).
• 13. Izadi N. et al.: Anal. Chim. Acta 1187, 339145 (2021).
• 14. Sebuyoya R. et al.: Biosens. Bioelectron. X 12, 100224 (2022).
• 15. Lobato I. M., O'Sullivan C. K.: Trends Anal. Chem. 98, 19 (2018).
• 16. Xu L. L. et al.: Anal. Chim. Acta 1148, 238187 (2021).
• 17. Sarhadi V. K., Armengol G.: Biomolecules 1, 1021 (2022).
• 18. Ondraskova K. et al.: Anal. Bioanal. Chem. 415, 1065 (2023).
• 19. Dankner M. et al.: Oncogene 37, 3183 (2018).
• 20. Sebuyoya R. et al.: Sens. Actuators, B 394, 134375 (2023).
• 21. Cortés-Ciriano I. et al.: Nat. Genet. 52, 331 (2020).
• 22. Müller D., Győrffy B.: Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1877, 188722 (2022).
• 23. Martisova A. et al.: Int. J. Mol. Sci. 22, 4247 (2021).
• 24. Mihelson N., McGavern D. B.: Viruses 13, 1264 (2021).
• 25. Bartosik M. et al.: Biosens. Bioelectron. 83, 300 (2016).
• 26. Manavi M. et al.: Int. J. Gynecol. Cancer 18, 285 (2008).
• 27. Collins S. I. et al.: Cancer Res. 69, 3828 (2009).
• 28. Lee R. C. et al.: Cell 75, 843 (1993).
• 29. He B. X. et al.: Int. J. Biol. Sci. 16, 2628 (2020).
• 30. Mo M. H. et al.: J. Cancer 3, 432 (2012).
• 31. Romano G. et al.: Cancers 13, 1526 (2021).
• 32. Shah M. Y., Calin G. A.: WIREs RNA 5, 537 (2014).
• 33. Bartosik M., Hrstka R.: Rev. Anal. Chem. 36, 20160022 (2017).
• 34. Jirakova L. et al.: Electroanalysis 31, 293 (2019).
• 35. Povedano E. et al.: Anal. Bioanal. Chem. 412, 5031 (2020).
• 36. Wright C. M.: in Epigenetic Cancer Therapy, Academic Press, Boston 2015.
• 37. de Kok J. B. et al.: Cancer Res. 62, 2695 (2002).
• 38. Bussemakers M. J. et al.: Cancer Res. 59, 5975 (1999).
• 39. https://www.bbmri.cz, staženo 15.6.2023.
• 40. https://directory.bbmri-eric.eu, staženo 15.6.2023.
• 41. https://negotiator.bbmri-eric.eu, staženo 15.6.2023.