LC/UV/HRAM MS-based impurity profiling and structure elucidation of phosphoramidite raw materials used for oligonucleotide synthesis

Význam tématu

Solid-fázová syntéza oligonukleotidů využívající fosforamiditovou chemii je klíčová pro vývoj terapeutických nukleových kyselin. S rostoucím počtem oligonukleotidů v klinickém výzkumu a vývoji je nutné přesně charakterizovat a kontrolovat přítomnost stopových nečistot ve výchozích fosforamiditových surovinách, protože tyto nečistoty mohou ovlivnit kvalitu a výtěžnost cílových oligonukleotidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost chromatograficko-hmotnostního systému Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC v kombinaci s vysokorozlišovacím Orbitrap Exploris 120 MS citlivě detekovat a kvantifikovat nečistoty fosforamiditových surovin na stopových úrovních (0,01 % a nižších) a zároveň jednoznačně odvodit jejich chemickou strukturu pomocí softwaru Compound Discoverer.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky 2’-modifikovaných RNA fosforamiditů (5’-DMT-2’-F-A(bz)-CEP) od čtyř různých dodavatelů byly rozpouštěny v anhydrotickém acetonitrilu při koncentraci 1 mg/mL. Pro validaci citlivosti byly do vzorku spikovány známé nečistoty v hladinách 0,1 %, 0,01 % a 0,001 %.

Chromatografie:

• Systém: Vanquish Horizon UHPLC
• Kolona: Accucore C18, 2,6 µm, 2,1×100 mm
• Mobilní fáze A: 10 mM acetát amonný ve vodě, B: acetonitril
• Gradient 30–95 % B za 14 min, návrat během 1 min
• Průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 45 °C

Hmotnostní spektrometrie:

• Systém: Orbitrap Exploris 120 MS s OptaMax NG H-ESI
• Režim polarity: střídání +/−, Top2 ddMS2, rozlišení Full MS 60 000, MS2 15 000 (@ m/z 200)
• Izolační okno 1,5 m/z, kolizní energie HCD 10, 20, 40 % NCE

Softwarová analýza:

• Chromeleon CDS 7.2.10 pro UV kvantifikaci a kvalitativní analýzu
• Xcalibur 4.5 a FreeStyle 1.8 SP2 pro inicialní revizi dat
• Compound Discoverer 3.3 SP1 s workflow „Impurity ID Related and Unknown with Molecular Networks“ pro detekci očekávaných i neočekávaných nečistot, přiřazení elementární složení a lokalizaci modifikací pomocí FISh fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

Spike-in experiment potvrdil detekci nečistoty na 0,01 % úrovni pomocí UV a až 0,001 % pomocí MS. Analýza čtyř dodavatelských šarží odhalila 25 nečistot, zahrnujících oxidované, demetylované, substituční a izomerní chlorační produkty. Softwarové workflow umožnilo:

• Jednoznačné stanovení elementárního složení a návrh modifikací na základě přesné hmotnosti a izotopických vzorců.
• Lokalizaci modifikačního místa na chránicích skupinách DMT nebo benzoyl podle posunu fragmentů v MS2 spektru (příklady nečistot methylace, chlorace).
• Rozlišení izomerů se substitucí chloru v různých polohách chránicích skupin.

Komparativní profilování ukázalo rozdílné množství kritických i nekritických nečistot napříč šaržemi a zvýraznilo význam strukturové charakterizace pro výrobní proces oligonukleotidů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost a selektivitu pro rychlou kontrolu kvality fosforamiditových surovin v laboratořích QA/QC a výzkumných centrech. Jednotná integrace LC/UV/MS dat a automatizované workflow zkracuje dobu identifikace a usnadňuje rozhodování o kritičnosti jednotlivých nečistot v produkčním procesu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizovaných datových workflow pro komplexní profilování velkých knih oligonukleotidů. Integrace umělé inteligence a strojového učení může zrychlit predikci možných nečistot a optimalizovat syntetické postupy. Rozšíření metod na jiné modifikované nukleosidy a porovnávání vzájemných impuritních sítí slibuje lepší kontrolu kvality i u nových terapeutických sloučenin.

Závěr

Popisovaná kombinace Vanquish Horizon UHPLC a Orbitrap Exploris 120 MS ve spojení s Compound Discoverer softwarem prokázala výjimečnou citlivost a spolehlivost při profilování a strukturním objasnění fosforamiditových nečistot. Metoda umožňuje rychlé odhalení stopových modifikací, jejich klasifikaci jako kritických či nekritických a významně podporuje vývoj a výrobu vysoce kvalitních terapeutických oligonukleotidů.

Reference

1. Roy S., Caruthers M.S. Synthesis of DNA/RNA and Their Analogs via Phosphoramidite and H-Phosphonate Chemistries. Molecules 2013, 18, 14268–14284.
2. Kiesman W.F. et al. Perspectives on the Designation of Oligonucleotide Starting Materials. Nucleic Acid Therapeutics 2021, 31, 93–113.
3. ICH Q3A(R) Impurities in New Drug Substances, 2003.
4. Comstock K., Du M. Impurity profiling of mycophenolate mofetil using an Orbitrap Exploris 120 mass spectrometer and Vanquish Horizon UHPLC combined with Compound Discoverer software. Thermo Fisher Scientific Application Note 000531, 2022.