The Effect of Working Electrode Gasket Thickness on the Sensitivity and Linearity of Carbohydrate Response by Pulsed Amperometric Detection

Význam tématu

Analytická stanovení sacharidů jsou klíčová v potravinářství, biotechnologiích, farmacii i výrobě biopaliv. Vysokovýkonná aniontová chromatografie spojená s pulzní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD) umožňuje přímou, selektivní a citlivou kvantifikaci jednoduchých i složených cukrů. Optimalizace podmínek detekčního článku, zvláště tloušťky těsnění elektrody, významně ovlivňuje citlivost, linearitu a rozsah stanovení, a tím i kvalitu analýzy.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo prokázat vliv tloušťky těsnění pracovní amperometrické elektrody (gasket) na citlivost (LOD, LOQ) a linearitu odezvy šesti reprezentativních sacharidů (fukóza, glukosamin, glukóza, xylóza, sacharóza, fruktóza) při použití HPAE-PAD. Studie porovnávala tři tloušťky těsnění (2, 15, 62 mil) za třech chromatografických režimů: standardní metodě na sloupci CarboPac PA20 a dvou režimech na sloupci SA10 s nebo bez postkolonální adice NaOH.

Použitá metodika a instrumentace

Analytické měření probíhalo na systému Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ HPIC s:

• DP pumpou s vakuovým odplyňovačem
• EG modul eluentního generátoru (KOH) a CR-ATC kolonkou pro bezuhlíkové eluenty
• DC modul s elektrochemickým detektorem PAD a samostatnou ED buňkou
• AS-AP autosampler s PEEK injekční smyčkou (0,4 µL) a čtyřportovým ventilem
• Amperometrický článek s pracovní zlatou elektro­dou na PTFE, pH-Ag/AgCl referencí, titaniovým protielektrodovým tělem
• Těsnění (gasket) z PTFE o tloušťce 2, 15 a 62 mil pro nastavení lineárního průtokového rozsahu
• Kolony Thermo Scientific Dionex CarboPac PA20 (3×150 mm) a SA10 (4×250 mm)

Metodicky se aplikovaly tři režimy:
• Metoda 1: PA20, isokratický KOH (10 mM), průtok 0,5 mL/min, injekce 10 µL
• Metoda 2: SA10, 1 mM KOH, průtok 1,5 mL/min, injekce 0,4 µL
• Metoda 3: jako metoda 2 s postkolonální adicí 200 mM NaOH (0,4 mL/min)

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost (LOD, LOQ) klesá s rostoucí tloušťkou těsnění – nejnižší LOD (0,007–0,054 mg/L) poskytuje 2 mil gasket v metodě 1. Tloušťší gasket (62 mil) rozšiřuje lineární rozsah až na 200 mg/L (metoda 1) či 2 000 mg/L (metoda 2) za cenu nižší citlivosti. Metoda 3 s postkolonální adicí NaOH dále zvyšuje lineární rozsahy (až 4 000 mg/L pro fruktózu) při zachování hodnot r² > 0,99, avšak pumpa přináší vyšší šum. Glukosamin vykázal nejširší lineární rozsah díky adsorpci aminoskupiny.

Přínosy a praktické využití metody

• Výběr tloušťky těsnění umožňuje optimalizovat kompromis mezi citlivostí a rozsahem stanovení podle koncentrace vzorku
• Tlustší gasket a menší injekční objem redukují nutnost manuálních ředění při vysokých koncentracích
• Postkolonální adice hydroxidu nabízí prostupné rozšíření lineárního rozsahu pro vzorky nad 1 g/L bez předchozích ředění

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj nových materiálů těsnění pro EUROPharm. aplikace, automatizovaná dávkování postkolonálního činidla, integrace HPAE-PAD s hmotnostní spektrometrií a mikrofluidními systémy pro online monitoring, analýzy komplexních oligosacharidů a kontinuální QC procesy v bioprodukci.

Závěr

Úpravou tloušťky těsnění pracovní elektrody lze efektivně řídit citlivost a lineární rozsah HPAE-PAD analýzy sacharidů. Pro běžné nízkokoncentrované vzorky stačí 2 mil gasket, zatímco pro vysoké koncentrace (až jednotky g/L) je vhodnější 15 či 62 mil ve spojení s metodou 2 nebo 3. Studie nabízí praktický návod pro volbu optimální konfigurace detekční buňky.

Reference

1. Brummer Y., Cui S.W. Understanding Carbohydrate Analysis. In: Food Carbohydrates: Chemistry, Physical Properties, and Applications; CRC Press, 2005, s. 67–104.
2. Hardy M.R., Rohrer J.S. High-pH Anion-Exchange Chromatography (HPAEC) and Pulsed Amperometric Detection (PAD) for Carbohydrate Analysis. In: Comprehensive Glycoscience; Elsevier, 2007, sv. 2, s. 303–327.
3. Thermo Scientific AN 282: Rapid and Sensitive Determination of Biofuel Sugars by Ion Chromatography. Sunnyvale, 2012.
4. Bhattacharyya L. Application of Ion Chromatography with Electrochemical Detection in Optimization and Control of Fermentation and Cell Culture. BioPharm International, 2011, 24, s. 12–20.
5. Thermo Scientific AU 192: Carbohydrate Determination of Biofuel Samples. Sunnyvale, 2014.
6. Szúnyog J., Adams E., Roets E., Hoogmartens J. Analysis of Tobramycin by Liquid Chromatography with Pulsed Electrochemical Detection. J. Pharm. Biomed. Anal., 2000, 23, s. 891–896.
7. Thermo Scientific TN 71: Eluent Preparation for High-Performance Anion-Exchange Chromatography with PAD. Sunnyvale, 2013.
8. Thermo Scientific TN 110: Carbohydrate Determination by HPAE-PAD with Disposable Au/PTFE Electrodes. Sunnyvale, 2011.
9. LaCourse W.R., Johnson D.C. Optimization of Waveforms for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates. Carbohydr. Res. 1991, 215, s. 159–178.
10. Thermo Scientific AN 1152: Determination of Carbohydrates in Kombucha Using HPAE-PAD. Sunnyvale, 2016.