Improved Size- Exclusion Chromatography of Adeno-Associated Viruses (AAVs) With XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm Columns

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) patří mezi klíčové analytické metody pro charakterizaci molekulárních agregátů v bioterapeutikách, zejména u adeno-asociovaných virů (AAV), které jsou základem mnoha genových terapií. Přesné stanovení monomerů i vyšších oligomerů je zásadní pro zajištění kvality a bezpečnosti konečného léčivého produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikovaného poznámky je představení nových kolonek XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 µm navržených pro analýzu AAV. Studie hodnotí jejich separační efektivitu, reprodukovatelnost a odolnost vůči sekundárním interakcím oproti tradičním SEC kolonám.

Použitá metodika a instrumentace

Uplatněné přístroje a podmínky:

• Chromatograf ACQUITY H-Class Bio Plus se čtyřkanálovým dávkovačem
• Detekce fluorescenčním detektorem (excitace 280 nm, emise 350 nm) a UV detektorem (230 a 260 nm)
• Vialy QuanRecovery s povrchem MaxPeak HPS pro minimalizaci adsorpcí
• Analytická kolona XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 µm 4.6 x 150 mm a guard kolona 4.6 x 30 mm
• Teplota kolony 25 °C, vzorku 6 °C, objem injekce 1 µL
• Mobilní fáze 10 mM fosforečnan draselný pH 7.4 s 200 mM chloridu draselného, filtrováno 0.2 µm
• Proud 0.25 až 0.6 mL/min

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza prokázala:

• Snížení velikosti částic z 5 µm na 2.5 µm vedlo k téměř čtyřnásobnému nárůstu početnosti desek (z 630 na 2760), aniž by se prodloužila doba analýzy
• Použití hydrofilního povrchu HPS omezilo sekundární interakce s kovovými částmi kolony, což zajistilo vysokou návratnost vysokomolekulárních agregátů
• Zvýšení průtoku na 0.6 mL/min umožnilo provést separaci za pět minut při zachování kvality rozlišení srovnatelného s pětkrát delšími běhy na standardní koloni
• Implementace guard kolony prodloužila životnost analytické kolony a mírně zvýšila rozlišení díky efektivní délce 180 mm

Přínosy a praktické využití metody

Výsledná metoda nabízí:

• Vyšší průchodnost laboratoří díky zkráceným analýzám
• Spolehlivé stanovení monomerů a agregátů bez nutnosti individuální optimalizace mobilní fáze pro různé serotypy
• Jednotný protokol vhodný pro QC laboratoře v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu
• Omezení ztrát vzorku a lepší reprodukovatelnost měření

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metody může zahrnovat kombinaci SEC s víceúhlou rozptylovou spektroskopií, využití částic s ještě menší velikostí pro zvýšení citlivosti nebo integraci s frakčním dělením pro detailní charakterizaci subpopulací virů. Inovace v povrchových úpravách a platformách pro online monitoring rozšíří aplikace v reálném čase.

Závěr

Použití XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 µm kolon výrazně vylepšuje analýzu AAV čímž umožňuje rychlejší, robustnější a reprodukovatelnější stanovení agregátů bez kompromisu kvality. Hydrofobní povrchy a menší částice přinášejí novou úroveň efektivity vhodnou pro rutinní i výzkumné aplikace.

Reference

1. Hong P Koza S Bouvier E S P Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates J Liq Chromatogr Relat Technol 2012 35 2923–2950
2. Gimpel A L Katsikis G Sha S et al Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapies Mol Ther Methods Clin Dev 2021 20 740–754
3. Deng C Quantifying AAV Aggregation and Quality Attributes by FFF-MALS Wyatt Technology Application Note AN2003
4. Bartalis J Chen M Why and How to Quantify Aav Aggregates by FFF-MALS Wyatt Technology Application Note AN2004
5. McIntosh N L Berguig G Y Karim O A Comprehensive Characterization and Quantification of Adeno Associated Vectors by Size Exclusion Chromatography and Multi Angle Light Scattering Sci Rep 2021 11 3012
6. Koza M K Chen W Size-Exclusion Chromatography Analysis of Adeno-Associated Virus Preparations Using a 450 Å Diol-Bonded BEH Column and Fluorescence Detection Waters Application Note 720006812 2020
7. Kizekai L Shiner S Lauber M A Waters ACQUITY and XBridge Premier Protein SEC 250 Å Columns A New Benchmark in Inert SEC Column Design Application Note 720007463 2022
8. Goyon A Beck A Colas O Sandra K Guillarme D Fekete S Evaluation of Size Exclusion Chromatography Columns Packed With Sub-3 μm Particles for the Analysis of Biopharmaceutical Proteins J Chromatogr A 2017 1498 80–89
9. Meng H Sorrentino M Woodcock D O Riordan C Dhawan V Verhagen M Davies C Size Exclusion Chromatography with Dual Wavelength Detection as a Sensitive and Accurate Method for Determining the Empty and Full Capsids of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors Hum Gene Ther 2022 33 202–212