Direct Analysis of Multicomponent Vaccine Adjuvants by HPLC with Charged Aerosol Detection

Význam tématu

Vakcínové adjuvanty výrazně zvyšují účinnost vakcinace tím, že modifikují imunitní odpověď a umožňují snížit dávku účinné látky nebo frekvenci očkování.
Různorodá chemická povaha adjuvantů (triterpenoidní saponiny, steroly, fosfolipidy) vyžaduje citlivé a univerzální analytické metody pro hodnocení síly, čistoty a stability formulací.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou a citlivou metodu HPLC kompatibilní s gradientním režimem pro přímé stanovení vícekomponentních adjuvantů včetně nechromoforových látek.
Metoda spočívá v obrácené fázové chromatografii s detekcí pomocí nabitého aerosolu (CAD) a komparaci s UV detekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografické podmínky:

• Stanovení uskutečněno na systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC
• Kolona Hypersil GOLD PFP, 2,1 × 100 mm, 1,9 µm, teplota 45 °C
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B: 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu/reag. alkoholu (10:90)
• Gradient 0–8 min z 35 % na 90 % fáze B, tok 0,5 mL/min, objem injekce 2 µL

Detektory:

• Corona Veo RS CAD: teplota odpařovače 50 °C, filtr 5 s
• DAD 210 nm pro komparaci citlivosti a baselinového driftu

Příprava vzorků a standardů:

• Jednotlivé a kombinované standardy saponinů, cholesterolu, DPPC a Lyso-PC v diluentu (30 % voda/70 % reagent alcohol)
• Rozpětí kalibrační křivky 0,38–400 µg/mL, vzorky AbISCO-100 v poměru 1:5 s vodou

Hlavní výsledky a diskuse

Štěpená fáze oddělila všechny čtyři analyty a hlavní degradační produkt Lyso-PC do 12 min.
CAD detektor prokázal vyšší citlivost a stabilní baselinu při gradientu oproti UV detektoru.
Retenční čas vykázal RSD < 0,1 %, plocha špiček RSD 0,7–1,5 % (n=10).
Kalibrační křivky čtyř analytů měly R² > 0,999 (kvadratický fit).
Meze detekce (LOD) v rozmezí 2–16 % RSD detekční limity v jednotkách ng na kolonu.
Analýza reálné vzorky potvrdila komplexnost eluce s rozdílným profilem oproti standardu a odhalila drobné neznámé impurity odhadnuté bez čistých standardů.

Přínosy a praktické využití metody

Univerzální CAD detekce umožňuje spolehlivě stanovit nechromoforové adjuvantní složky a jejich degradační produkty bez nutnosti každého standardu.
Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu jakosti, vývoj nových adjuvantních formulací a stabilitní studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace CAD s vyššími průtoky a automatizovanými pracovními stanicemi pro vysokoprostupovou analýzu.
Možnosti rozšíření na další třídy adjuvantů a polymorfních lipidních formulací.
Standard-free kvantifikace s využitím pokročilých kalibračních modelů (Hubaux-Vox) a multikomponentní analýzy.
Případná kombinace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci neznámých impurit.

Závěr

Vyvinutá HPLC metoda s CAD detekcí splňuje požadavky na rychlou, citlivou a univerzální analýzu vakcínových adjuvantů.
Dosahuje vysoké přesnosti, linearity a nízkých detekčních limitů i pro látky bez UV chromoforu.
Metoda usnadňuje kvantifikaci složek a impurit v komplexních formulacích.

Reference

1. Heidorn M., Martin M., Steiner F., Plante M., McLeod F. Towards Standard-Free Quantitative and Qualitative Analysis in Liquid Chromatography. Thermo Fisher Scientific Application Note 2011, LPN 2881-01.
2. Pedersen G.K. et al. T-helper 1 cells elicited by H5N1 vaccination predict seroprotection. J. Infect. Dis. 2012;206(2):158–166.
3. Picard M.D. et al. High-throughput proteomic screening identifies Chlamydia trachomatis antigens ... Vaccine 2012;30(29):4387–4393.