Analysis of Cationic Lipids Used as Transfection Agents for siRNA with Charged Aerosol Detection

Význam tématu

Transfekce malých interferenčních RNA (siRNA) představuje perspektivní přístup v léčbě závažných onemocnění (rakovina, AIDS, diabetes, makulární degenerace, hepatitida). Cílené dodání siRNA do buněk vyžaduje stabilní a vysoce čisté nosiče, přičemž kationické lipidy jsou nejčastěji využívanými transfekčními činidly. Kontrola kvality těchto lipidů – zejména stanovení jejich čistoty a množství – je nezbytná jak pro výzkum, tak pro průmyslové i klinické aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem publikace bylo vyvinout a validovat chromatografickou metodu na bázi vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) spojené s detekcí nabitých aerosolů (Charged Aerosol Detection, CAD) pro kvantitativní stanovení pěti běžně používaných kationických lipidů (DC-Chol, DOTAP, DDAB, DOTMA, DOPE). Metoda měla nabídnout nízké meze detekce (LOD), široký dynamický rozsah a spolehlivou detekci nechromoforických látek, a umožnit i studium čistoty komerčně dostupných směsí a stability formulací.

Použitá metodika a instrumentace

Byl použit systém Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC s kolonou Fused-Core C8 (2,7 µm, 150×4,6 mm). Mobilní fáze A: voda/methanol/trifluoroctová kyselina (600:400:1), fáze B: isopropanol/tetrahydrofuran/trifluoroctová kyselina (750:250:1). Gradientní režim (0–20 min z 45 % B na 75 % B, návrat do původních podmínek k 25. minutě), průtok 0,5 mL/min, teplota kolony 45 °C, objem injekce 2 µL. Detekce probíhala pomocí Corona ultra CAD (teplota nebulizéru 15 °C, filtr vysoké intenzity), vzorky připraveny v methanol/chloroform (1:1) v rozmezí 3–2000 ng na koloně.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LOD <2–5 ng na koloně a LOQ <7–15 ng, kalibrační křivky druhého řádu vykazovaly koeficienty determinace >0,9995 v rozsahu 3–2000 ng. Reprodukovatelnost (RSD) byla <5 % pro všechny koncentrace nad 12,5 ng. Stanovení čistoty: DC-Chol ~94,9 %, DDAB ~98,8 %, DOTMA ~100 %, u DOTAP a DOPE nebyly detekovány významné nečistoty (>0,1 %). Analýza tří komerčních směsí transfection agent ukázala dobrou separaci hlavních složek i stopových nečistot. Stabilitní studie v reverzní fázi prokázala vznik degradantu, který se objevil po 8 dnech skladování při pokojové teplotě.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost (až 20× lepší než ELSD) a široký dynamický rozsah umožňují detekovat nečistoty až na úrovni 0,1 %.
• Detektor CAD nabízí jednotnou odpověď nezávislou na chemické struktuře, bez nutnosti derivatizace ani UV chromoforu.
• Jednodušší provoz a nižší náklady než u hmotnostní spektrometrie.
• Vhodné pro rutinní analýzu kvality kationických lipidů v laboratorních i průmyslových podmínkách.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další typy netěkavých biomolekul (peptidy, polymery, nanocarriery).
• Integrace s automatizovanými platformami pro vysokopropustné analýzy.
• Implementace do regulačních postupů a standardů pro siRNA léčiva.
• Další zlepšení detektoru CAD pro UHPLC a ultra-citlivé aplikace.

Závěr

Vyvinutá HPLC-CAD metoda pro stanovení kationických lipidů splňuje požadavky na vysokou citlivost, přesnost a opakovatelnost. Díky univerzální detekci je mimořádně vhodná pro kvantifikaci a kontrolu kvality siRNA transfection agentů, přispívá k efektivnějšímu vývoji a validaci farmaceutických produktů.

Reference

• Downward J. RNA Interference. British Medical Journal 2004, 328, 1245–1248.
• Pitkänen L.; Ruponen M.; Nieminen J.; Urtti A. Vitreous Is a Barrier in Nonviral Gene Transfer by Cationic Lipids and Polymers. Pharm. Res. 2003, 4, 576–583.
• Narang A.; Thoma L.; Miller D.; Mahato R. Cationic Lipids with Increased DNA Binding Affinity for Nonviral Gene Transfer in Dividing and Nondividing Cells. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 156–168.
• Severian Dumitriu (Ed.). Polymeric Biomaterials: Second Edition. 2002, p. 813.
• Zhong Z.; Ji Q.; Zhang J. A. Analysis of Cationic Liposomes by Reversed-Phase HPLC with Evaporative Light-Scattering Detection. J. Pharm. Biomed. Anal. 2010, 51(4), 947–951.
• ESA, A Dionex Corporation. Corona ultra for UHPLC, Response Consistency.
• Dionex Corporation. Improving the Quantitation of Unknown Trace Impurity Analysis of Active Pharmaceutical Ingredients. 2010.