GPC/SEC-MALLS Analysis of Hyaluronic Acid

Význam tématu

Hyaluronová kyselina (HA) představuje biologicky významný makromolekulární polymér, který nachází široké uplatnění v medicíně, farmaceutickém výzkumu a kosmetice. Její viskoelastické vlastnosti a biologická kompatibilita závisí především na molekulové hmotnosti a distribuci řetězců, což klade vysoké nároky na přesné analytické metody pro stanovení těchto parametrů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předložené studie je demonstrovat využití kombinace gelové permeační/velikostní exkluzní chromatografie (GPC/SEC) a detekce víceúhlého rozptylu světla (MALLS) společně s refraktometrickou detekcí (RI) pro získání absolutních hodnot molekulové hmotnosti HA. Studie porovnává výsledky tohoto přístupu s konvenční kalibrací na pullulanových standardech.

Použitá metodika a instrumentace

Metodické parametry:

• Mobilní fáze: pufrované fyziologické roztoky (PBS), pH 7,4
• Průtok: 0,5 mL/min
• Objem injekce: 100 µL
• Koncentrace vzorku: 0,5 mg/mL
• Detektory: refrakční index (RI) a vícerozměrný rozptyl světla při vlnové délce 638 nm
• Software: Agilent WinGPC

Použitá instrumentace:

• Agilent isokratické čerpadlo
• Autosampler Agilent
• Kolonový systém Agilent SUPREMA: prekolona 8 × 50 mm, 10 µm; analytické kolony 8 × 300 mm, 10 µm, póry 30 Å a 10 000 Å
• Agilent ReadyVLS-Kit Dextran/Pullulan pro MALLS

Hlavní výsledky a diskuse

Ukázalo se, že konvenční kalibrace na pullulanových standardech vede k nadsazeným hodnotám průměrné hmotnosti Mw (až trojnásobek ve srovnání s MALLS). GPC/SEC-MALLS umožnila kvantifikovat skutečnou molekulovou hmotnost HA (Mw cca 1,2 × 10^6 Da), zatímco konvenční metoda udala přibližně 3,8 × 10^6 Da. Vysoká obnova vzorku (blízká 100 %) a průběh klesající molekulové hmotnosti s objemem eluátu potvrzují správnost separace podle hydrodynamické velikosti.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda GPC/SEC-MALLS s online RI detekcí přináší:

• Absolutní stanovení molekulové hmotnosti HA bez reliance na standardy
• Odstranění systematické chyby způsobené rozdíly v konformaci pullulanu a HA
• Vysokou přesnost a reprodukovatelnost vhodnou pro kvalitu, výzkum i průmyslovou kontrolu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje analýzy HA a obdobných polymerů:

• Inline stanovení refrakčního přírůstku dn/dc pro zvýšení automatizace
• Integrace mikrofluidních systémů pro snížení spotřeby vzorku
• Pokročilé algoritmy a strojové učení pro rychlejší a přesnější vyhodnocení rozptylových dat
• Rozšíření aplikace na další biopolymerní materiály a nano­částice

Závěr

GPC/SEC-MALLS analýza s Agilent SUPREMA kolony poskytuje robustní a spolehlivé stanovení molekulové hmotnosti hyaluronové kyseliny. Absolutní detekce rozptylem světla odstraňuje omezení konvenční kalibrace a významně zvyšuje přesnost kvantifikace.

Reference

• Gupta R. C. et al. Veterinary Pharmacology and Toxicology, Volume 6, 2019.
• Lavrenko P. N.; Linow K.-J.; Gornitz E. In Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1992, pp 517–531.