Determination of Inorganic Anions and Organic Acids in Fermentation Broths

Význam tématu

Analýza anorganických aniontů a organických kyselin ve fermentačních nálevech je nezbytná pro kontrolu a optimalizaci biotechnologických procesů. Koncentrace uhlíkových zdrojů (cukry, alkoholové kvasinky) a metabolických vedlejších produktů (laktát, acetát, formiát) ovlivňuje výtěžek konečného produktu a kvalitu fermentace. Robustní, citlivá a selektivní metodika umožňuje časově efektivní monitoring během růstu mikroorganismů, detekci kontaminace a řízení kvality ve výrobě bioterapeutik, biopaliv, potravin a nápojů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo porovnat dvě iontoměničové kolony (IonPac AS11 a AS11-HC) se supresní vodivostní detekcí pro simultánní stanovení běžných anorganických aniontů (chlorid, bromid, dusičnan, síran, fosforečnan) a organických kyselin (acetát, laktát, formiát, pyruvát, malát apod.) v kvasinkových (Saccharomyces cerevisiae) a bakteriálních (Escherichia coli) fermentačních médiích. Studie představuje chromatografické podmínky, výkonnostní parametry a ukázky analýzy vzorků z reálné kultivace.

Použitá metodika a instrumentace

Ionové chromatografie byly provedeny na systému Dionex DX-500 BioLC s gradientním čerpadlem GP40, supresním detektorem ED40 (ASRS AutoSuppression®, recyklační režim, 300 mA) a kolonami:

• IonPac AS11 (analytická) + AG11 (ochranná), průtok 2,0 mL/min, gradient 0,5–38 mM NaOH, teplota ambientní
• IonPac AS11-HC (analytická) + AG11-HC (ochranná), průtok 1,5 mL/min, gradient 1–60 mM NaOH, teplota 30 °C
• ATC-1 aniontový trap mezi pumpou a vzorkovačem pro odstranění karbonátů

Eluenty připraveny z 50 % NaOH, dekarbonizované a inertně napuštěné He. Standardy aniontů (chlorid, bromid, síran, fosforečnan, organické kyseliny) v rozsahu ng–µg úrovní. Vzorky fermentačních roztoků byly centrifugovány, zředěny (10×, 100×) a injikovány přímo.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání kolonek ukázalo, že AS11-HC má šestinásobně vyšší kapacitu než AS11, což umožňuje vyšší nálože vzorku a lepší rozlišení raně eluujících kyselin (laktát vs. acetát vs. formiát). Oba systémy dosahují separace všech 25 sledovaných aniontů do 40 min.
Detekční limity (S/N=3, 10 µL inj.) jsou pro klíčové anionty 0,5–4 ng (chlorid, síran, fosfát, ii) a linearita nad 0,999 pro rozsahy 1–1000 ng až 1–120 ng. Repeteabilita retenčních časů i ploch (<1 % RSD) a plošné přesnosti (<2 % RSD) byla zachována po 96 h kontinuální analýzy.
Obnova aniontů ve vyhřátém kvasinkovém supernatantu byla 88–101 %. Reálné kultivační vzorky ukázaly dynamické změny: laktát a acetát rostou v průběhu 24 h, fosfát klesá, některé organické anionty zůstávají konstantní nebo náhodně kolísají.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• simultánní a rychlý monitoring více aniontů v komplexních mediích
• nízké detekční limity vhodné pro stopové analýzy
• široké lineární oblasti snižující potřebu ředění či opakování
• vysokou reprodukovatelnost i při dlouhodobém běhu
• snadnou integraci do bioprocesního monitoringu a QA/QC protokolů

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směruje k on-line spojeným systémům iontové chromatografie s bioreaktory, dalšímu vylepšení selektivity pomocí organických modifikací elučního roztoku, využití pulzní amperometrie pro nekonduktometrické detekce, a rozšiřování aplikace do metabolomických studií a procesního inženýrství (PAT).

Závěr

Studie prokázala, že iontová chromatografie se supresní vodivostní detekcí a kolonami IonPac AS11/AS11-HC je spolehlivou a všestrannou technikou pro analýzu aniontů ve fermentačních médiích. Kombinace vysoké kapacity, selektivity a citlivosti poskytuje robustní nástroj pro kontrolu a optimalizaci biotechnologických procesů.

Použitá instrumentace

• Dionex DX-500 BioLC (GP40, ED40, LC30/LC25, AS3500, PeakNet)
• IonPac AS11, AS11-HC, AG11, AG11-HC, ATC-1
• Supresní detektor ASRS AutoSuppression®, 300 mA

Reference

1. Dionex Corporation. Ion Chromatography in the Pharmaceutical Industry. Application Note 106, 1995.
2. Rabin S. et al. New membrane-based electrolytic suppressor device for suppressed conductivity detection. J. Chromatogr. 1993, 640, 97–109.
3. Robinett R.S.R. et al. Determination of inorganic cations in fermentation media. J. Chromatogr. A 1995, 718, 319–327.
4. Joergensen L. et al. Ion chromatography as a tool for optimization of fermentation processes. J. Chromatogr. 1992, 602, 179–188.
5. Loconto P.R., Hussain N. Automated coupled ion exclusion-ion chromatography. J. Chromatogr. Sci. 1995, 33, 75–81.
6. Forman L.W. et al. On-line monitoring and control by flow-injection analysis. Anal. Chim. Acta 1991, 249, 101–111.
7. Huang Y.L. et al. Flow-injection analysis-wall-jet electrode system. Anal. Chim. Acta 1993, 283, 763–771.
8. Schugerl K. et al. Monitoring and control of recombinant protein production. Anal. Chim. Acta 1993, 279, 3–16.
9. Gey M. et al. Fast LC determination of organic acids in fermentation media. Anal. Chim. Acta 1988, 213, 227–230.
10. Buttler T. et al. Characterization of a sampling unit based on tangential flow filtration. Anal. Chim. Acta 1993, 279, 27–37.
11. Dionex Corporation. Determination of carbohydrates, alcohols, and glycols in fermentation broths. Application Note 122, 2006.