Simple Evaluation of Cultured Cells: Evaluation of Differentiation State of iPS Cells Using Benchtop MALDI-TOF MS

Význam tématu

Evaluace růstového stavu a diferenciace lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPS buněk) má klíčový význam v regenerativní medicíně, výzkumu a QA/QC testování. Tradiční metody, jako PCR nebo imunofenotypizace, jsou časově náročné a vyžadují složitou přípravu vzorků. Kombinace benchtop lineárního MALDI-TOF hmotnostního spektrometru a automatizovaného zpracování dat nabízí rychlou alternativu pro hodnocení stavu buněk a kultivačních médií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit možnost rozlišování nediferencovaných a diferencovaných iPS buněk a jejich kultivačních médií pomocí přímého měření MALDI-TOF MS. Byla použita benchtop platforma Shimadzu MALDI-8020 a automatizační software Sample Station™/AuraSolution™. Statistická analýza dat proběhla v eMSTAT Solution™.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu buněk:

• Buňky byly sklizeny, dvakrát vypláchnuty v PBS, precipitovány 10% trichloroctovou kyselinou ultrazvukem a centrifugovány při 10 000 × g.
• Pellet byl resuspendován v acetonitrilu a smíchán v poměru 1:1 s matricí CHCA (5 mg/ml v 50% acetonitril/0,1% TFA).
• Na MALDI destičku bylo naneseno 1 µl směsi buněk/matrix, zasušeno a měřeno.

Pro analýzu kultivačního média:

• 0,5 µl supernatantu kultury bylo smícháno s 0,5 µl CHCA matrix a naměřeno obdobným postupem.

Použitá instrumentace

• Shimadzu MALDI-8020 benchtop lineární MALDI-TOF MS
• Software Sample Station™/AuraSolution™ pro automatizaci měření
• eMSTAT Solution™ pro multivariační statistickou analýzu
• CHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamová kyselina) jako matrice

Hlavní výsledky a diskuse

• Spektrální data iPS buněk ve třech stavech (nediferencované sféry, diferencované sféry, adherentní diferencované buňky) se pomocí eMSTAT multivariačně seskupila do tří odlišných clusterů.
• Kultivační média se podle doby kultivace a přítomnosti séra či gelatiny rovněž diferencovala, přičemž skupina diferencovaného média ze 7. dne se blížila výsledkům kultivačního média použitím gelové vrstvy.
• Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost a schopnost diskriminovat jemné změny buněčného stavu bez nutnosti značkování ani složité přípravy vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy při minimalizaci laborativních kroků.
• Možnost vysokopropustného zpracování více vzorků najednou díky automatizaci.
• Bezdotykové měření přímo z kultivačního média umožňuje sledování stavu buněk v reálném čase.
• Uplatnění v průmyslové výrobě buněčných terapií, QC farmaceutických preparátů a základním výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace umělé inteligence pro prediktivní analýzu výsledků a rozšíření aplikace na další typy buněk.
• Vývoj miniaturizovaných MALDI-TOF instrumentů pro in situ monitoring kultivací.
• Propojení s lab-on-a-chip platformami a automatizovanými bioreaktory pro plně digitalizovaný tok dat.

Závěr

Kombinace benchtop lineárního MALDI-TOF MS s automatizovanou analýzou a multivariační statistikou umožňuje rychlé, spolehlivé a netoxické hodnocení diferenciace iPS buněk a jejich kultivačních médií. Metoda nabízí značné úspory času a laborativní práce, čímž podporuje široké uplatnění v biotechnologiích i farmaceutickém průmyslu.

Reference

• Shimadzu Corporation. First Edition: June 2019.
• Kratos Analytical Ltd. AuraSolution™ a SampleStation™ – trademarks.
• Cellular Dynamics International, Inc. Essential 8™ – trademark.