Sensitive Bioanalysis of Antisense Oligonucleotides of Various Lengths and Modifications

Význam tématu

Antisense oligonukleotidy (ASO) představují rostoucí třídu terapeutických molekul s širokým potenciálem v léčbě genetických a virových onemocnění. Přesné kvantitativní stanovení ASO v biologických matricích je klíčové pro farmakokinetické studie, bezpečnostní hodnocení a optimalizaci dávek. Moderní LC-MS/MS přístupy zajišťují vysokou citlivost a selektivitu potřebnou pro subng/ml koncentrace v lidské plasmě.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat výkonnost systému Waters Xevo TQ Absolute propojeného s ACQUITY Premier UPLC a C18 kolonkou pro bioanalýzu ASO různých délek (18–33 nukleotidů) a chemických modifikací (2’-MOE, fosforotioát, GalNAc konjugát). Studie se zaměřila na citlivost, linearitu a reprodukovatelnost metody v rozsahu 0,1–1000 ng/ml.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lidské plazmy byly spikeovány ASO standardy (Eluforsen, Fomivirsen, Mipomersen, Nusinersen, GalNAc-oligo) v koncentracích od 0,1 do 1000 ng/ml. Extrakce proběhla kapalně-kapalnou extrakcí (LLE) z 100 µl plazmy. Jako interní standard byl použit GEM91 (100 ng/ml). Chromatografie byla vedena na ACQUITY Premier UPLC s C18 kolonou pro oligonukleotidy. Mobilní fáze A: 100 mM hexafluoroisopropanol (HFIP) + 15 mM DIPEA ve vodě; fáze B: 90 % acetonitril se stejnou aditivní směsí. Detekce probíhala na Xevo TQ Absolute ve vysoce citlivém negativním ionizačním módu pomocí optimalizovaných MRM přechodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající linearitu (r2 > 0,99 při vážení 1/x2) a reprodukovatelnost (duplicitní kalibrátory, šest replik QC na třech dnech splnily kritéria ±15 %, v LLOQ ±20 %). LLOQ dosáhlo 0,1 ng/ml (0,2 ng/ml pro GalNAc oligo) v rozmezí 0,1–1000 ng/ml. Technologie MaxPeak HPS snížila nespecifickou vazbu a absorpci kovů, čímž se zvýšil poměr signál/šum a zlepšily limity detekce.

Přínosy a praktické využití metody

• Schopnost měřit sub-ng/ml koncentrace ASO v lidské plasmě.
• Široký dynamický rozsah podporuje farmakokinetické studie a PK/PD modelování.
• Robustní a reprodukovatelná metoda vhodná pro rutinní bioanalytické laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní analýzy různých ASO kombinací ve stejném běhu.
• Nástup mikroproudových LC-MS/MS pro úsporu spotřebního materiálu a vzorků.
• Rozšíření metod na jiné biologické matrice (tkáně, cerebrospinální tekutina).
• Integrace s vysoce rozlišovacími MS platformami pro strukturální charakterizaci metabolitů.

Závěr

Studie potvrdila vysokou citlivost a spolehlivost systému Xevo TQ Absolute spojeného s ACQUITY Premier UPLC pro kvantitativní bioanalýzu antisense oligonukleotidů různých délek a chemických modifikací. Metoda splňuje přísné požadavky PK studií a otevírá cestu k dalším aplikacím v oblasti vývoje nukleotidových terapií.

Reference

1. Suma Veeramachineni, Mark D Wrona, Sensitive LC-MS/MS Bioanalytical Quantitation of Antisense Oligonucleotides, Waters Application Notes 720007574, březen 2022.