A complete workflow for improved untargeted metabolome annotation and identification using ultra high- resolution accurate mass and LC-MSn Orbitrap-based mass spectrometry

Význam tématu

Analýza metabolitů v lidské plazmě je zásadní pro pochopení biochemických procesů, objevování nových biomarkerů a zlepšení diagnostiky. Vysoce spolehlivá identifikace neznámých sloučenin podporuje kvalitu výsledků v klinickém a průmyslovém výzkumu.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na ověření účinnosti kombinovaného workflow, které spojuje neřízenou (untargeted) a polosledovanou (semi-targeted) metabolomickou analýzu. Cílem bylo potvrdit identitu referenčních standardů v NIST SRM1950 lidské plazmě pomocí ultra vysokého rozlišení LC–MS a datově závislé MS2 analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky SRM1950 plazmy byly precipitovány methanolem a doplněny referenčními směsmi standardů. Analýza probíhala na:

• UHPLC Vanquish se sloupcem Thermo Hypersil GOLD C18 (2,1×150 mm, 1,9 μm, 45 °C)
• Tribridním Orbitrap ID-X (ESI, pozitivní a negativní režim, MS1 rozlišení 120 000, MS2 rozlišení 30 000)

Data zpracovávala software Compound Discoverer 3.1 s prohledáváním databází ChemSpider, HMDB, KEGG, LipidMaps a spektroskopickými knihovnami mzCloud a lokální mzVault.

Hlavní výsledky a diskuse

• Z 58 referenčních standardů bylo jednoznačně identifikováno 56 sloučenin s průměrnou chybou hmotnostního rozpadu < 0,1 ppm.
• Shoda retenčních časů a MS2 fragmentačních vzorů potvrdila vysokou věrohodnost anotací.
• Neidentifikován zůstal izomer kyseliny levulinové a stearoyl ceramid kvůli nízké koncentraci.
• Skóre shod v knihovně mzCloud dosahovalo až 91 a v lokální mzVault až 90.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow nabízí:

• Integrovanou neřízenou i polosledovanou analýzu v jednom běhu.
• Široké pokrytí metabolomu a vysokou úroveň důvěry v identifikaci.
• Využití v klinických výzkumech, QA/QC laboratořích a biomarkerovém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektrálních a chemických databází a zdokonalení algoritmů pro anotaci.
• Implementace strojového učení pro rychlejší a přesnější identifikace fragmentů.
• Zvýšení citlivosti metodiky pro detekci nízkoabundantních metabolitů.

Závěr

Kombinace neřízeného a polosledovaného workflow na bázi ultra vysokého rozlišení LC–MS poskytuje robustní a vysoce spolehlivou platformu pro identifikaci metabolitů. Potvrzení identity 56 z 58 standardů dokazuje vhodnost přístupu pro komplexní metabolomické studie.

Reference

1. L W Sumner et al., Proposed minimum reporting standards for chemical analysis, Metabolomics, 2007, 3, 231–241. DOI: 10.1007/s11306-007-0082-2