Pathway Targeted Metabolomic Analysis in Oral Cancer Cells Using High Performance Ion Chromatography Coupling to a New HR/AM Orbitrap Mass Spectrometry

Význam tématu
Metabolomika založená na vysoce výkonné iontové chromatografii (IC) v kombinaci s orbitrapovou hmotnostní spektrometrií (HR/AM MS) nabízí citlivou a selektivní analýzu polárních metabolitů. V kontextu výzkumu rakoviny ústní dutiny umožňuje rozlišení isobarických a izomerických sloučenin a kvantifikaci klíčových meziproduktů trikarboxylové kyseliny (TCA) cyklu. To přispívá k pochopení metabolických změn spojených s invazivním fenotypem nádorových buněk.

Cíle a přehled studie / článku
Cílem práce bylo demonstrovat spojení vysokotlaké IC (Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ HPIC) s vysokorozlišovacím Q Exactive HF orbitrapem pro cílenou kvantitativní analýzu TCA cyklu v lyzátech buněk rakoviny ústní sliznice. Současně se ověřila možnost využití HR/AM plnoskenovacího módu pro kvantifikaci pomocí stabilně značených izotopových standardů.

Použitá metodika a instrumentace
V tomto projektu byly použity kultury buněčných linií HNSCC (UM1, UM2, UMSCC5, UMSCC6) s různou invazivitou. Extrakce metabolitů proběhla rychlým zmrazením v tekutém N2 a odbouráním ledovin metanol–voda. K cílené analýze bylo využito 6 stabilně značených TCA standardů (pyruvát, malát, fumarát, sukcinát, α-ketoglutarát, citrát) ve 11 kalibračních úrovních.

• Iontová chromatografie: Dionex ICS-5000+ HPIC se zdrojnicovým potlačením elektrolytu (AERS 500), kolona IonPac AS11HC-4 µm (2 × 250 mm), průtok 0,38 mL/min s postkolonovým přídavkem MeOH/HAc (2 mM) 0,06 mL/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Q Exactive HF, ESI-negativní mód, full-scan m/z 67–1000, rozlišení až 240 000, AGC 1×10^6, injekční čas 100 ms.
• Zpracování dat: diferenciální profilace v Thermo Scientific SIEVE; cílená kvantifikace v TraceFinder 3.2 s externími izotopovými kalibračními křivkami.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizovaná IC rozlišila strukturální izomery (např. glukózo-6P vs. fruktózo-6P) během 20 min, s retenční reprodukovatelností < 2 s v 150 vložkách.
• LOQ pro značené TCA metabolity dosáhly 0,1 pg/µL (CV < 15 %) a lineární rozsah přes 5 řádů (R2 > 0,995).
• Cílené kvantifikace v HR/AM plnoskenovacím módu vykazují shodu s diferenciální neřízenou analýzou.
• Vysoce invazivní linie UM1 a UMSCC5 vykazují zvýšené hladiny pyruvátu, citrátu, α-ketoglutarátu, sukcinátu a fumarátu oproti méně invazivním UM2 a UMSCC6, což potvrzuje aktivnější TCA cyklus.

Přínosy a praktické využití metody
Nová platforma poskytuje rychlou vysokovýkonnou separaci s vynikající reprodukovatelností a citlivostí pro metabolomické studie rakovinných buněk. Cílená kvantifikace HR/AM full-scan módem usnadňuje validaci biomarkerů a podporuje přechod od neřízeného profilování k přesnému kvantitativnímu sledování metabolických drah.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na klinické vzorky (tkáně, krevní plazma) pro onkologickou diagnostiku a prognózu.
• Integrace s dalšími směrovými a nestrukturovanými metodami metabolomiky pro komplexní pohled na buněčné metabolické sítě.
• Automatizace datových analýz a využití strojového učení pro objev nových metabolických signálů spojených s invazivitou tumoru.

Závěr
Vysoce výkonná IC v kombinaci s HR/AM Orbitrap hmotnostní spektrometrií představuje robustní nástroj pro cílenou kvantifikaci TCA cyklu v rakovinných buňkách. Metoda umožňuje rychlé, přesné a citlivé stanovení klíčových metabolitů a odhaluje rozdíly v metabolismu invazivních a neinvazivních buněčných linií.

Reference

1. Wang J. et al., Anal. Chem., 2014, 86, 5116–5124.
2. Lorenz M.A. et al., Anal. Chem., 2011, 83, 3406–3414.