A multi-detector platform comprising UV/Vis, charged aerosol, and single quadrupole mass spectrometric detection for comprehensive sample analysis

Význam tématu

Multi-detektorová UHPLC analýza s kombinací UV/Vis, Charged Aerosol Detector (CAD) a hmotnostní spektrometrie doplňuje možnosti identifikace a kvantifikace neznámých složek, degradantů i extraktabilních a uvolnitelných látek v komplexních vzorcích, kde by jediný detektor vynechal řadu analytů. Celistvý přístup je kritický v oblasti farmaceutického vývoje a kontroly kvality, biotechnologií a environmentální analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit spolehlivou detekci, identifikaci a kvantifikaci přítomných nežádoucích látek (nečistoty, degradáty, extraktabilní a uvolnitelné látky) pomocí platformy Thermo Scientific Vanquish UHPLC propojené s ISQ EC/EM single quadrupole MS. Pro zvýšení detekčního rozsahu byla použita tři doplňková detekční uspořádání a dvě ionizační techniky (HESI, APCI). Metoda byla demonstrována na testu extraktů z vrstev jednoúčelových kultivačních vaků.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Reverzní fáze na Accucore C18 (100×2,1 mm, 2,6 µm), gradient H2O/formic acid ↔ isopropanol, 0,5 mL/min, teplota kolonky 45 °C.
• Příprava vzorků: 18 referenčních standardů z literatury připraveno 1–50 µg/mL v MeOH; extrakty z vaků 50:50 isopropanol/voda, následná rehydratace.
• UHPLC systémy: Vanquish Flex v konfiguracích standardní a invertované gradientní (dual pump), statické mixéry (200 µL), rozdělovač průtoku 2:1 pro CAD/MS.
• Detektory: DAD (210, 220, 254, 280, 300, 320 nm a 190–345 nm 3D), Charged Aerosol Detector (35 °C, 3,6 filter, power function 1,0), single quadrupole MS ISQ EC/EM s ionizátory HESI a APCI.
• Software: Chromeleon 7.2.9 CDS pro řízení přístrojů, sběr a vyhodnocení dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Komplementarita detektorů: UV/Vis detekuje analyty s chromofory, CAD univerzálně detekuje ne-/semi-volatilní látky. Spojením obou a MS bylo možné detekovat všech 18 referenčních standardů.
• HESI vs APCI: 16 ze 18 sloučenin bylo detekováno v obou režimech, liší se ale citlivostí (BHT preferuje APCI, palmitová kyselina HESI). Obě ionizační techniky minimalizují riziko opomenutí špatně ionizovatelných látek.
• Invertovaný gradient: Vykazuje vyrovnanější odpověď CAD pro analyty elutující v různém poměru organika/voda, což umožňuje kvantifikaci neznámých látek jedním univerzálním kalibrantem (např. bisfenol A) s chyby ±10 % pro většinu analytů.
• Analýza extraktů vaků: Identifikace a kvantifikace klíčových extraktabilních látek ve vrstvách vaků – erucamid, stearová kyselina a oxidované produkty ochranných látek (Irgafos 168), dále neznámé sloučeniny potvrzené MS.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní screening neznámých a nízkomolekulárních extraktovatelných a uvolnitelných látek v bioprocesní a farmaceutické výrobě.
• Univerzální detekce i kvantifikace bez nutnosti referenčního standardu pro každou látku díky CAD s invertovaným gradientem.
• Rychlá identifikace pomocí MS a podpora vedení dalšímu toxikologickému či regulačnímu vyhodnocení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie pro potvrzení empirických vzorců a struktury neznámých látek.
• Automatizace workflows a využití umělé inteligence pro pokročilou analýzu a predikci nežádoucích látek.
• Rozšíření detekčního portfolia o další komplementární techniky (např. NMR, ICP-MS) pro širší spektrum analytů.
• Standardizace metodiky pro regulace FDA/EMA v oblasti leachables/extractables a bezpečnost bioprocesů.

Závěr

Popsaná multimodální platforma Vanquish UHPLC s DAD, CAD a ISQ EC/EM MS v kombinaci HESI a APCI umožňuje komplexní analýzu složitých vzorků, detekci a kvantifikaci neznámých i známých látek bez nutnosti individuálních standardů. Implementace invertovaného gradientu značně zlepšuje uniformitu odpovědi CAD a podporuje rychlé a spolehlivé výsledky v oblasti kvality farmaceutických, biotechnologických a environmentálních analýz.

Reference

1. Dorival-García N.; Bones J. Monitoring leachables from single-use bioreactor bags for mammalian cell culture by dispersive liquid-liquid microextraction followed by UHPLC-QTOF MS. J. Chromatogr. A 2017, 1512, 51–60.
2. Norwood D.L.; Jenke D.; Manolescu C.; Pennino S.; Grinberg N. HPLC and LC/MS analysis of pharmaceutical container closure system leachables and extractables. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2009, 32, 1768–1827.
3. Asa D.; Carreiro D. Extractable and leachable measurements by universal HPLC detection. Application Notebook 2007, 65.
4. Menz M.; Eggart B.; Lovejoy K.; Acworth I.; Gamache P.; Steiner F. Charged aerosol detection – factors affecting uniform analyte response. Thermo Fisher Scientific Technical Note 72806, 2018.