Measuring the purity of low volumes of DNA at 4 °C using the Agilent Cary 60 UV-Vis spectrophotometer with fiber optics microprobe

Význam tématu

Měření čistoty a koncentrace DNA v mikrolitrových objemech přímo za chladicími podmínkami zajišťuje rychlou a spolehlivou kontrolu kvality biologických vzorků bez zbytečné manipulace a časových prodlev. Tato metoda minimalizuje spotřebu vzorků i spotřebního materiálu a předchází kontaminaci během přenosu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je demonstrovat využití UV-Vis spektrofotometru Agilent Cary 60 s příslušenstvím vláknové optiky pro měření čistoty DNA při 4 °C přímo z chladničky. Studie porovnává časovou efektivitu i přesnost s konvenčními metodami založenými na mikrokyvetách.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr s WinUV softwarem
• Fiber optic microprobe a coupler (model 7910035600 a G6866A)
• Křemenné kyvety (1 cm, G6860AA)
• Calf Thymus DNA (Sigma D-4764)
• Deionizovaná voda (MilliQ)

Metodika

Vzorky DNA v koncentracích 0–50 µg/mL byly připraveny v deionizované vodě. Měření se provádělo v 150 µL objemech přímo v Eppendorf tube při 4 °C bez předchozího ohřátí. Spektrální skeny v rozsahu 340–240 nm byly analyzovány modulem RNA-DNA estimation softwaru WinUV. Pro hodnocení čistoty se automaticky počítal poměr A260/A280 s odečtem pozadí při 320 nm. Po každém vzorku byla sonda opláchnuta vodou.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila změření pěti vzorků za méně než dvě minuty, což představuje více než 80procentní úsporu času oproti tradičnímu postupu s mikrokyvetami. Byla prokázána vynikající linearita (R2 0,9976) a reprodukovatelnost výsledků. Díky bezkontaktní sondě se výrazně snižuje riziko kontaminace a manipulace se vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza bez nutnosti ohřevu vzorku
• Minimální objemy vzorku (již od 40 µL)
• Úspora spotřebního materiálu a nákladů
• Široká aplikovatelnost na různé biologické matricě
• Bez rizika kondenzace a chybných měření

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na stanovení proteinů, gelových a pevných vzorků
• Integrace do automatizovaných a inline analýz
• Vývoj vícekanálových vláknových sond pro paralelní měření
• Kombinace se separačními technikami pro komplexní analýzy

Závěr

Agilent Cary 60 UV-Vis se sondou vláknové optiky představuje efektivní a spolehlivý nástroj pro rychlé stanovení čistoty DNA za chladicích podmínek. Významná úspora času, nákladů a eliminace manipulace se vzorky činí metodu atraktivní pro biotechnologické a QC laboratoře.

Reference

1. Warburg O, Christian W (1942) Biochem Z 310:384.
2. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
3. Keighley B, Fyfe D (1995) Application Note 91, Agilent Technologies.