Reducing carryover in high-sensitivity low-flow LC-MS analysis: the comprehensive study of multi-wash, ZebraWash, and large volume injections

Význam tématu

Trap-and-elute LC-MS workflowy na nízkoprůtokových systémech často trpí problematickým carryover, které omezuje citlivost a přesnost kvantifikace. Automatizovaná procedura ZebraWash nabízí rychlé a efektivní čištění trap i separační kolony bez nutnosti mezičetných výměn, čímž zvyšuje spolehlivost a propustnost analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vyhodnocení účinnosti ZebraWash na systémech Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC pro redukci carryover v nano/cap proteomických aplikacích. Součástí bylo také testování velkoobjemových injekcí pomocí multi-draw funkce až do 500 µl.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC systém: Thermo Scientific Vanquish Neo s EASY-Spray PepMap Neo trap kolonkou a Acclaim PepMap C18 separační kolonkou.
• MS detekce: Orbitrap Exploris 480 v režimu datově závislé akvizice (DDA).
• Příprava vzorku: HeLa digest standard doplněný PRTC, finální koncentrace 200 ng/µl, sonikace a opakované aspirace.
• ZebraWash: Opakované střídání silné (3 µl) a slabé (3 µl) fáze, volitelně 2–16 cyklů podle velikosti vzorkové smyčky.
• Multi-draw injekce: Až 500 µl objemu s 0,1 % TFA jako nosným pufrem bez ztrát peptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

• ZebraWash snížila carryover z trap kolony pod 0,05 % až při dávce 4 µg HeLa peptidů.
• Čtyři cykly ZebraWash přinesly lepší účinnost než standardní Fast Wash při stejné spotřebě silného roztoku.
• Oddělené čištění trap a separační kolony s 16 cykly vedlo k carryover pod 0,004 %.
• Porovnání velkoobjemových (500 µl) a nízkoobjemových (5 µl) injekcí prokázalo srovnatelnou kvalitu chromatogramů, počty peptidů i proteinů.
• Vysoká korelace peptidových oblastí (r > 0,99) potvrzuje reprodukovatelnost multi-draw injekcí.

Přínosy a praktické využití metody

Procedura umožňuje automatizované a rychlé odstranění carryover v proteomických analýzách s vysokou citlivostí a reprodukovatelností. Multi-draw funkce rozšiřuje možnosti analýzy vzorků s nízkou koncentrací (např. po imunoprecipitaci) bez potřeby sušení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace počtu cyklů a složení wash pufrů pro různé typy vzorků.
• Použití sloupců s větším vnitřním průměrem pro rychlejší praní.
• Integrace do pokročilých automatizovaných workflow v proteomice a metabolomice.
• Využití multi-draw ve klinických a environmentálních analýzách vyžadujících vysokou citlivost.

Závěr

ZebraWash na systému Vanquish Neo přináší nový standard pro efektivní redukci carryover v trap-and-elute nanoLC-MS analýzách. Kombinace s multi-draw injekcemi rozšiřuje možnosti práce s objemnými a zředěnými vzorky při zachování vysoké kvality dat.

Reference

• Zheng R., Pynn C., Samonig M. et al. Reducing carryover in high-sensitivity low-flow LC-MS analysis: the comprehensive study of multi-wash, ZebraWash, and large volume injections. Thermo Fisher Scientific, 2022.