Combining mass spectra, retention time modelling, and charged aerosol detection for unambiguous peak annotation and uniform-response quantitation in polysorbate profiling

Význam tématu

Polysorbát-80 (PS80) je široce využívaný neiontový surfaktant v parenterálních léčivých přípravcích. Vzhledem k jeho komplexnímu složení, kdy polyoxyethylenované sorbitany a isosorbitany esterifikované mastnými kyselinami tvoří řadu podobných sloučenin, je přesná analýza klíčová pro zajištění stability, kvality a konzistence šarží. Tradiční HPLC detekce UV spektrem nepostačuje, proto se uplatňují aerosolové detektory (CAD) a hmotnostní spektrometrie (MS) pro spolehlivé profilování podtříd a sledování degradace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a ověřit UHPLC metodu s invertovaným gradientem kombinující simultánní detekci prostřednictvím CAD a jednovičného kvadrupólového MS. Metoda má umožnit:

• kvantifikaci PS80 komponent se stejnou odpovědí bez ohledu na jejich hydrofobitu,
• jednoznačnou identifikaci špiček na základě retenčního času a MS spekter,
• sledování rozdílů mezi šaržemi a degradace pod vlivem enzymů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorcem připravený PS80 v koncentraci 2 mg/mL byl pro degradaci inkubován s rekombinantní lidskou lipoproteinovou lipázou po dobu 5 dní při 37 °C. Analýzy proběhly na systému Thermo Scientific Vanquish Flex Duo UHPLC s kolonou Accucore C18 (2,1×100 mm, 2,6 µm) při 50 °C. Mobilní fáze A byla 5 mM methylamonný fosforečnan pH 4,8 a fáze B směs 50:50 acetonitril/isopropanol. Tok 0,4 mL/min a objem injekce 10 µL s multi-krokovým gradientem byl doplněn invertovaným „make-up“ tokem pro konstantní složení po rozdělení. Detekce probíhala současně CAD (20 Hz, evaporátor 50 °C, power function 1,5) a ISQ EM jednovičný kvadrupólový MS (scany 350–2000 m/z, ionizace +3 kV / –3 kV pro olejovou kyselinu).

Hlavní výsledky a diskuse

Kapilární mixer mezi analytickým a make-up tokem zajistil homogenní složení a stabilní split ratio, což je nezbytné pro reprodukovatelnou odpověď obou detektorů. CAD za invertovaného gradientu poskytl uniformní signál pro různé PS80 podtřídy, přičemž nejhojnější sub-kategorií bylo sorbitan-POEn-oleát (retence 17–19 min). Retenční model, založený na závislosti retenčního času na molekulové hmotnosti a stupni esterifikace, byl integrován do Chromeleon CDS pro automatické přiřazení špiček. Enzymová degradace ukázala kompletní rozklad monoesterů na polyoly a uvolnění olejové kyseliny, jejíž identita byla potvrzena v negativním režimu MS.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší následující výhody:

• uniformní CAD kvantifikaci bez nutnosti individuálních kalibrací,
• spolehlivé přiřazení složek díky kombinaci retence a MS signálu,
• možnost sledování stability a enzymatické degradace surfaktantu,
• jednoduchou obsluhu v rámci standardního Chromeleon CDS bez pokročilého MS školení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Do budoucna lze metodu rozšířit o vysokorozlišovací MS, strojové učení pro predikci retenčních časů, integraci dalších detektorů (např. UV, ELSD) a aplikaci na jiné komplexní excipienty či lipidomické studie. Vysokopropustné platformy a automatizace dále zvýší efektivitu QA/QC procesů.

Závěr

Navržená UHPLC metoda se simultánní detekcí CAD a MS při invertovaném gradientu poskytuje robustní a univerzální nástroj pro detailní profilování polysorbátu-80. Umožňuje přesnou kvantifikaci, jednoznačnou identifikaci komponent i sledování degradace, což významně podporuje vývoj, validaci a kontrolu kvality biotechnologických přípravků.

Reference

Ispan Denis A., Carillo Sara, Bones Jonathan, Cook Ken, Steiner Frank, De Pra Mauro. Combining mass spectra, retention time modelling, and charged aerosol detection for unambiguous peak annotation and uniform-response quantitation in polysorbate profiling. Thermo Fisher Scientific, 2022.