Seamless automated sample preparation and analysis of DUID samples using high-resolution DIA QTOF library screening

Význam tématu

Testování vzorků oral fluid při podezření na řízení pod vlivem drog a léků je klíčové pro rychlou a spolehlivou forenzní i klinickou diagnostiku. Oral fluid nabízí neinvazivní odběr v terénu a zároveň zachycuje aktuální expozici cizorodým látkám. Zavedení plně automatizované přípravy vzorků propojené s vysokorozlišeným QTOF spektrometrem přináší urychlení procesů, vyšší reproducibilitu a možnost retrospektivních analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Studie mapuje vývoj a ověření workflow pro emergenční screening vzorků oral fluid u případů DUID (Driving Under the Influence of Drugs). Hlavními cíli byly:

• Porovnání plně automatizované přípravy a analýzy s validovaným QuEChERS protokolem a triple kvadrupólovým MRM screeningem.
• Posouzení citlivosti, přesnosti a opakovatelnosti výsledků pro panel kokainu, amfetaminů a opioidů.
• Zhodnocení možnosti nativního i retrospektivního nesíťového vyhledávání dalších látkových skupin.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky oral fluid byly odebírány suchým tamponem FLOQSwab, extrahovány do fosfátového pufru a zpracovány:

• Automatizovaná příprava pomocí platformy CLAM-2030 (Shimadzu): aktivace filtru methanolem, přidání interních standardů, vyvločkování acetonitrilem, šetrné míchání, filtrace 0,45 µm, přímá injekce.
• Validovaný QuEChERS protokol pro srovnání: extrakce, čištění sorbenty, injekce na triple kvadrupólový LC-MS/MS (Shimadzu LCMS-8050).
• Vysokorozlišená analýza na QTOF přístroji Shimadzu LCMS-9030 s DIA-MS/MS (MS rozsah m/z 70–1000, DIA rozsah m/z 40–1000, 20 Da okna, CE spread 5–55 V, cyklus 0,975 s).
• Chromatografie na Shim-pack Velox Biphenyl kolóně s gradientem vodní fáze a methanolu obohaceného formiátovým pufrem.
• Knihovny: interní MS/MS spektra autentických standardů, Wiley Data Repository a další spektrální databáze (HighResNPS, Maurer/Meyer/Helfer/Weber).

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaná metoda vykázala vysokou shodu s referenčním QuEChERS protokolem (regrese slope = 0,96, R2 = 0,91). Nejčastěji detekované látky v pacientských vzorcích byly kokain, benzoylecgonin a ecgonin-methylester. DIA-MS/MS knihovní screening poskytl vysoké skóre podobnosti spekter a přesnost hmotnosti pod 5 ppm. Retrospektivní vyhledávání neznámých látek umožnilo identifikaci heroinových metabolitů (6-MAM, noscapin, codein), které původní cílený screening nezahrnoval. Software LabSolutions Insight zjednodušil interpretaci pomocí barevného flagování kritérií shody (hmotnost, izotopové rozdělení, retence, knihovní skóre).

Přínosy a praktické využití metody

Plně automatizovaný workflow výrazně zkracuje dobu přípravy vzorků, minimalizuje ruční kroky a snižuje riziko kontaminací. Kombinace vysokého rozlišení a DIA knihovního vyhledávání zajišťuje vysokou jistotu identifikace a kvantifikace směsí psychoaktivních látek. Retrospektivní analýza umožňuje rozšíření spektra vyšetřovaných látek i po ukončení měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace umělé inteligence pro automatické rozpoznávání neznámých signálů, rozšíření spektrálních knihoven o nové drogy a metamolity a vývoj přenosných vysokorozlišených systémů přímo na místě odběru. Dále lze očekávat integraci s LIMS pro nepřetržité sledování kvality a automatické reportování.

Závěr

Vyvinutý plně automatizovaný workflow s CLAM-2030 a QTOF LCMS-9030 pro vzorky oral fluid u DUID případů splnil očekávání v oblasti rychlosti, přesnosti i šíře detekce. Metoda demonstrovala vysokou shodu s konvenčním triple kvadrupólovým MRM screeningem a otevřela cestu k retrospektivnímu i nesíťovému screening u složitých vzorků.

Reference

V textu nebyly uvedeny samostatné literární reference.