Automating Rapid High-Throughput LC-MS mAb Subunit Screening of Microbioreactor Cell Culture Samples

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří mezi nejrychleji rostoucí třídy biopharmaceutik a hrají klíčovou roli v léčbě řady onemocnění. Pro výběr optimálních klonů a vývoj výrobních procesů je nezbytné rychle a spolehlivě měřit kritické vlastnosti mAb, jako jsou glykosylace, oxidace nebo odštěpení C-terminálního lyzinu. Vysokopropustné automatizované analytické platformy tak mohou zásadně zkrátit dobu vývoje a zvýšit efektivitu laboratoří.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je popsat plně automatizovanou metodiku purifikace, enzymatické štěpení a redukce mAb na subjednotky přímo ze vzorků mikrobioreaktorových buněčných kultur. Výsledný pracovní postup kombinuje Protein A affinitní extrakci, štěpení FabRICATOR® (IdeS) proteázou a DTT redukci s rychlou LC-MS analýzou na systému Waters™ BioAccord™. Klíčovým záměrem je dosáhnout plně automatizovaného zpracování 96 vzorků s nízkými objemy (<100 µL) během několika hodin.

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postup zahrnuje:

• Automatizovanou extrakci mAb z buněčné kultury pomocí magnetických Protein A částic na platformě Andrew+ Pipetting Robot se zařízeními Shaker+ a Magnet+.
• Eluci pročistěné protilátky v kyselém pufru a následnou neutralizaci.
• Štěpení na úrovni Fab/Fc pomocí FabRICATOR (IdeS) a redukci disulfidických můstků DTT, což vytváří tři subjednotky (~23–25 kDa): lehký řetězec, Fd’ a Fc/2.
• Rychlou reverzně-fázovou UPLC na kolóně BioResolve RP mAb Polyphenyl (2.7 µm, 450 Å, 2.1×100 mm) na ACQUITY UPLC I-Class PLUS, 4,5min gradient (0.1 % FA ve vodě/ACN) při 0,4 mL/min, TUV detektor a teplota 80 °C.
• MS detekci na ACQUITY RDa systému v módu ESI+ (50–2000 m/z, 2 Hz, cap. vol. 1.5 kV, cone 30 V) s lock-massem.
• Software pro řízení a analýzu: waters_connect s INTACT Mass App a UNIFI v2.1.2.14.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol dosahuje výkonu srovnatelného s manuální přípravou:

• Časová efektivita: ~2 h pro 8 vzorků, ~3 h pro 48 vzorků.
• Široký rozsah koncentrací: od 0,5 µg do 10 µg mAb na vzorek.
• Reprodukovatelné chromatogramy a hmotové spektra subjednotek s hmotnostní přesností <20 ppm.
• Možnost sledovat glykované varianty Fc/2 subjednotky a relativní zastoupení modifikací.
• Čistota a kvalita subjednotek zajištěna purifikací Protein A; nepročištěné vzorky vykazují nižší účinnost štěpení a horší signál.

Přínosy a praktické využití metody

Tato workflow umožňuje:

• Rychlý screening klonů a optimalizaci buněčných kultur v raných fázích vývoje.
• Snížení pracovní zátěže analytiků díky plné automatizaci přípravy vzorků.
• Efektivní využití středně cenově dostupných LC-MS přístrojů pro charakterizaci subjednotek.
• Možnost integrace do stávajících QA/QC a procesních kontrolních postupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj v oblasti:

• Miniaturizace a zvýšení paralelismu – nasazení v mikrofluidních/ mikrobioreaktorových systémech s ještě nižšími odběry.
• Pokročilá data science a strojové učení pro automatizovanou interpretaci výsledků a predikci kvality mAb.
• Rozšíření metody na jiné formáty bioterapeutik, např. konjugáty ADC nebo rekombinantní proteiny.

Závěr

Plně automatizovaný postup purifikace a subjednotkové LC-MS analýzy mAb umožňuje vysokopropustný screening vzorků z buněčných kultur s nízkými objemy. Metoda nabízí vysokou reprodukovatelnost, rychlost a přesnost, což podporuje efektivní vývoj a monitorování bioprodukce terapeutických protilátek.

Reference

1. Lu RM, Hwang YC, Liu IJ et al. Development of Therapeutic Antibodies for the Treatment of Diseases. J Biomed Sci. 2020;27(1):1.
2. Dong J, et al. High-Throughput, Automated Protein A Purification Platform with Multiattribute LC-MS Analysis for Advanced Cell Culture Process Monitoring. Anal Chem. 2016;88:8673–8679.
3. Shion H, et al. INTACT Mass™ – a Versatile waters_connect™ Application for Rapid Mass Confirmation and Purity Assessment of Biotherapeutics. Waters Application Note 720007547. Feb 2022.
4. Morrison L, et al. Direct LC-MS Characterization of Glycoform Distribution and Low Molecular Weight Impurities in mAb Process from Ambr® 15 Bioreactors. Sartorius Application Note. 29 March 2022.
5. Wagner-Rousset E, et al. Antibody-Drug Conjugate Model Fast Characterization by LC-MS Following Ides Proteolytic Digestion. mAbs. 2014;6(1):173–184.
6. Kuhn E, Fabbami L, van den Heuvel Z, Murphy S, Jaffe JD, Carr SA. Automation of the Multiplexed Peptide Immune-MRM-MS Workflow on Bravo AssayMAP Platform. Broad Institute; Agilent Technologies.