Targeted Screening of Fungal and Plant Metabolites in Wheat, Corn, and Animal Feed Using Automated Online Sample Preparation Coupled to Orbitrap LC-MS

Význam tématu

Mykotoxiny a sekundární rostlinné metabolity představují významné riziko pro kvalitu a bezpečnost potravin a krmiv. Jejich detekce vyžaduje citlivé a selektivní analytické metody, protože jde o sloučeniny různé polarity a stability, často se vyskytující v komplexních matricích. Vysoké rozlišení a hmotnostní přesnost Orbitrap LC-MS umožňuje spolehlivou identifikaci cílových toxinů i při nízkých koncentracích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou on-line metodiku pro cílený screening 21 plísňových a rostlinných metabolitů obilovin a krmiv (pšenice, kukuřice, krmné směsi) s využitím automatizované přípravy vzorku s TurboFlow a detekcí Orbitrap LC-MS. Metoda byla navázána na dříve ověřenou analýzu fusariových mykotoxinů a rozšířena o další sloučeniny a formy (maskované, prekurzory).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly homogenizovány (5 g), extrahovány 45 min v kyselém vodno-acetonitrilovém činidle (0,1 % FA) a filtrovány 0,2 µm nylonovým filtrem. Extrakt se automaticky čistil pomocí Thermo Scientific Transcend TLX-1 (TurboFlow technologie) spojeným s analytickou kolónou Hypersil GOLD (C18). Náplň TurboFlow Cyclone MCX a gradient v Aria software seřídily separaci a odstranily interferující matricové složky před Orbitrap Exactive HRMS analýzou (rozlišení 100 000 @ m/z 200, přesnost mass < 5 ppm).

Použitá instrumentace

• Transcend TLX-1 systém s TurboFlow Cyclone MCX cartridgem
• LC-MS systém Thermo Scientific Exactive Orbitrap
• Analytická kolona Hypersil GOLD, 50 × 4,6 mm, 5 µm
• Autosampler CTC Analytics (10 °C, injekční objem 10 µL)
• Laboratorní vybavení: ultrazvuková lázeň, váhy, pipety

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou účinnost v cíleném screeningu, s 99 % potvrzených nebo identifikovaných analytů (1 % nevyhovujících). Limit detekce se pohyboval pod legislativními limity. Validace podle EU doporučení pro screening metody odhalila nulový podíl falešně pozitivních nálezů a reprodukovatelné výsledky v matricích kukuřice, pšenice i krmných směsí. Kontrolní materiály FAPAS a Römer Labs potvrdily spolehlivost identifikace i fragmentační potvrzení pomocí HCD.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované on-line čištění a vysoce přesná HRMS detekce výrazně zkracují dobu analýzy (< 18 min běh), snižují pracovní zátěž a eliminují ruční SPE kroky. Metodu lze aplikovat ve výzkumných i rutinních QA/QC laboratořích pro screening širokého spektra mykotoxinů a rostlinných toxinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je rozšíření databáze o nové metabolity a maskované formy, zlepšení kvantifikace metodou MRM/PRM a integrace umělé inteligence pro pokročilou analýzu spekter. Potenciálně lze přejít na ještě vyšší rozlišení ultrarychlých mass analyzátorů a multi-kriteriální potvrzování.

Závěr

Vyvinutá metoda představuje robustní, rychlý a spolehlivý přístup k cílenému screeningu plísňových a rostlinných toxinů v zemědělských produktech. Je v souladu s legislativními požadavky a umožňuje hromadné monitorování rizikových látek v potravinářském a krmivářském sektoru.

Reference

1. European Commission. Regulation (EC) No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. Off J Eur Union L 364:5–24. 2006.
2. European Commission. Regulation (EC) No 1126/2007 amending Regulation 1881/2006 as regards Fusarium toxins in maize. Off J Eur Union L255:14–17. 2007.
3. European Commission. Recommendation 2006/576/EC on presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T‐2, HT‐2 and fumonisin in animal feed. Off J Eur Union L229:7–9. 2006.
4. Ates E, Mittendorf K, Stroka J, Senyuva H. Determination of Fusarium mycotoxins in wheat, maize and animal feed using on‐line clean‐up with high resolution mass spectrometry. Food Addit Contam A. 2012; doi:10.1080/19440049.2012.729162.
5. Commission Decision 2002/657/EC on performance of analytical methods and interpretation of results. Off J Eur Union L221:8–36. 2002.
6. Community Reference Laboratories Residues. Guidelines for validation of screening methods for veterinary medicine residues. CRL. 20/1/2010.
7. Senyuva H, Gilbert J, Öztürkoglu S. Rapid analysis of fungal cultures and dried figs for secondary metabolites by LC/TOF‐MS. Anal Chim Acta. 2008;617:97–106.
8. Nielsen KF, Smedsgaard J. Fungal metabolite screening: database of 474 mycotoxins and fungal metabolites for dereplication by LC‐UV‐MS. J Chromatogr A. 2003;1002:11–36.
9. Mol HGJ, Dam RCJ, Zomer P, Mulder PPJ. Screening of plant toxins in food, feed and botanicals using full‐scan high‐resolution mass spectrometry. Food Addit Contam. 2011;28(10):1405–1423.
10. Cole RJ, Cole RH. Handbook of Toxic Fungal Metabolites. Academic Press; 1981.