Automated Extraction of a Drugs of Abuse Panel from Human Urine Using Biotage® Extrahera™ LV-200 and Microelution SPE Prior to UPLC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Detekce a kvantifikace omamných látek v biologických vzorcích je zásadní pro toxikologii, forenzní i klinickou praxi. Spolehlivá a efektivní příprava vzorku z močového matrixu minimalizuje matrixové efekty v LC-MS/MS analýze, urychluje workflow a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit automatizovaný protokol pro extrakci širokého panelu drog z lidské moči pomocí systému Biotage Extrahera LV-200 a mikroeluce SPE destiček Biotage Mikro CX. Protokol měl zajistit vysoké výtěžky (> 60 %) s nízkou variabilitou (RSD < 5 %) a lineárnost kalibračních křivek (r2 > 0,999) v rozsahu 1–1000 pg/mL.

Použitá metodika a průběh analýzy

Vzorky moči byly doplněny o směs deuterovaných interních standardů, enzymaticky hydrolyzovány β-glukuronidázou a potom naředěny pufrem NH4OAc pH 5. SPE extrakce zahrnovala:

• podmínění mikrodestiček methanolem,
• equilibraci 4% H3PO4,
• nanesení vzorku (400 µL) v několika cyklech,
• dvoufázové praní (4% H3PO4 a 50:50 vody/methanolu),
• eluci analyzátů DCM/MeOH/NH4OH (78:20:2, v/v),
• sušení eluátu a re-konsituci do 30 µL vodno-methanolické směsi (90:10) s 0,1 % kyseliny formiové.

Použitá instrumentace

• Biotage Extrahera LV-200 pro automatizaci SPE,
• Biotage Mikro CX 96-well SPE destičky (2 mg/místo),
• TurboVap 96 Dual k sušení extraktů,
• Biotage PRESSURE+ 96 manifold pro manuální SPE srovnání,
• UHPLC Shimadzu Nexera s kolonkou Restek Raptor Biphenyl 2,7 µm (100×2,1 mm),
• MS Shimadzu 8060 Triple Quadrupole (ESI, pozitivní mód).

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol dosáhl průměrných výtěžků větších než 60 % u většiny z více než 50 sledovaných látek, s maximálními RSD pod 5 % (n=7). Lineární kalibrační křivky (1–1000 pg/mL) měly koeficient determinace r2 > 0,999. Nízké LOQ (1–500 pg/mL dle látky) umožňují citlivou detekci klinicky relevantních koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká automatizace zkracuje čas na přípravu 96 vzorků na ~25 min bez post-procesních kroků,
• nízké objemy elučních fází minimalizují spotřebu rozpouštědel,
• modulární platforma umožňuje přepojení na manuální režim bez změny validity metody,
• metoda je aplikovatelná pro forenzní i klinickou toxikologii, QA/QC a dopingové kontroly.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat rozšíření panelu o nové psychoaktivní látky, integraci předanalytické automatizace s LIMS, flexibilní úpravu protokolu pro různé matrixy (plazma, krev) a adaptaci pro ultrarychlé chromatografické techniky či HRMS.

Závěr

Popsaný automatizovaný postup pro extrakci omamných látek z moči kombinuje efektivitu, reprodukovatelnost a citlivost, které uspokojí požadavky moderní toxikologie. Metoda je robustní, snadno replikovatelná a připravená pro rutinní provoz ve výzkumu i diagnostice.

Reference

• Biotage Application Note AN964.v1 (2022). Automated Extraction of Drugs of Abuse from Urine Using Biotage Extrahera LV-200 and Microelution SPE.