Bioanalytical Sample Preparation

Význam tématu

V moderní bioanalytické praxi je příprava vzorku klíčovým krokem pro zajištění kvalitních, reprodukovatelných a citlivých výsledků při analýze biologických matric LC-MS/MS či GC-MS. Správná volba a optimalizace metod čistí vzorek od interferujících složek, snižuje náklady na údržbu přístrojů, zvyšuje robustnost měření a umožňuje dosahovat nízkých detekčních limitů při vysokém počtu vzorků.

Cíle a přehled článku

Článek přináší přehled hlavních přístupů k přípravě biologických vzorků: od nejjednodušších metod (dilute & shoot, filtrace) přes proteo­ srážení (PPT) a odstraňování fosfolipidů (PLD), až po pokročilé cílené extrakce (DME, LLE, SLE, SPE, micro-SPE). Dále popisuje vliv volby metody na citlivost, časovou náročnost a možnosti automatizace, zohledňuje různé typy biofluid a uvádí doporučení pro eliminaci nepotřebných kroků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro následnou analýzu je využívána LC-MS/MS a GC-MS. Příprava vzorků probíhá v test­tube zařízeních nebo v 96-well mikrodestičkách, s využitím tlakových nebo vakuových manifoldů, případně plně automatizovaných pracovních stanic. Klíčové pomůcky: SPE kolony a destičky, micro-SPE kazety, filtrační jednotky, mikro­titrační destičky pro PPT/PLD, in-well frity umožňující vnitrobuněčnou hydrolýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dilute & shoot a filtrace představují nejrychlejší cestu, ale nerespektují matriční efekty a snižují citlivost.
• PPT odstraní bílkoviny, PLD účinně čistí vzorky od fosfolipidů, chrání LC kolony i MS zdroj.
• DME kombinuje enzymatickou hydrolýzu konjugátů v moči s odstraňováním solí, pigmentů a proteinů; aplikace in-well eliminuje přepipetování.
• LLE je osvědčená, ale obtížně automatizovatelná; SLE zachovává chemii LLE a umožňuje paralelní zpracování.
• SPE a micro-SPE přinášejí nejvyšší čistotu a možnost koncentrace analyty bez dodatečné evaporace; výběr sorbentu (silika vs. polymer), režimu (reverzní fáze, ion-exchange, mixed-mode) a velikosti pórů má zásadní vliv na čistotu a kapacitu.
• Matrice vyžadují odlišný přístup: moč (hydrolýza konjugátů, DME/SLE), krevní plazma/serum (proteiny, lipidový obsah), ústní tekutina (pufry, surfaktanty v odběrových sadách) i pevné vzorky (tkaně, vlasy).
• Automatizace (vakuum vs. tlak) a eliminace kroků (in-well hydrolýza, polymerová média bez kondicionace) snižují variabilitu i dobu přípravy.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší kvalita dat a robustnost stanovení díky eliminaci interferujících složek.
• Snížení provozních nákladů a údržby přístrojů díky čistotě vzorků.
• Možnost dosahovat nízkých detekčních limitů (micro-SPE, SPE s koncentrací).
• Zvýšení throughputu a reproducibility při použití 96-well formátů a automatizace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálší miniaturizace a integrace přípravy vzorku s analytickou linkou.
• Vývoj nových mixed-mode sorbentů a sorbentů šetrných k životnímu prostředí.
• Využití strojového učení a umělé inteligence pro predikci optimálních podmínek extrakce.
• Automatické platformy s online odběrem, přípravou a analýzou vzorku.

Závěr

Volba vhodné metody přípravy vzorku závisí na požadavcích laboratoře, typu analyzované matrice, požadované citlivosti a throughputu. Neexistuje univerzální řešení, proto je nutné pečlivě zvážit kompromisy mezi jednoduchostí, citlivostí, náklady a možností automatizace.

Reference

• Biotage. Bioanalytical Sample Preparation White Paper, 2020.
• Chromedia. Plasma Composition Data, 2020.