Sample Preparation for Fentanyl Analogs in Whole Blood

Význam tématu

Opioidní analgetika, zejména fentanyl a jeho analogy, se významně podílejí na rostoucí krizi předávkování v USA i dalších regionech. Spolehlivá detekce a kvantifikace těchto látek v krevních vzorcích má klíčový význam pro klinická toxikologická vyšetření, postmortální analýzy a forenzní praxi. Přesná a robustní příprava vzorku z celkové krve umožňuje minimalizovat matrixové efekty a dosáhnout nízkých limitů kvantifikace, což je rozhodující pro včasné odhalení expozice i vyšetření příčin úmrtí.

Cíle a přehled studie

Cílem whitepaper je představit a porovnat různé extrakční techniky pro izolaci fentanylových analogů z celkové krve. Studie hodnotí podporovanou kapalinnou extrakci (SLE+) a pevnou fázi (SPE) na dvou typech sorbentů, porovnává výtěžnost, maticové efekty i časovou efektivitu jednotlivých metod a doporučuje optimální postupy pro různé analytické požadavky.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci vzorků z celkové krve byly testovány následující přístupy:

• Podporovaná kapalinná extrakce (ISOLUTE SLE+): diatomitový sorbent, eluční rozpouštědla DCM, EA nebo MTBE.
• Pevná fáze – směsově-kationtový sorbent ISOLUTE HCX (silika) a polymerní sorbent EVOLUTE EXPRESS CX, využívající nepolární a iontoměničové interakce.

Extrahované látky zahrnovaly 16 fentanylových analogů a metabolitů. Po extrakci se vzorky koncentrovaly do sucha a rekonstituovaly ve 50 µl mobilní fáze pro LC-MS/MS analýzu.
Instumentace:

• Vysokotlaká kapalinová chromatografie: Shimadzu Nexera X2 s kolonou Restek Raptor Biphenyl (100×2,1 mm, 2,7 µm), 40 °C, isokratický režim 50:50 0,1% kyselina mravenčí ve vodě / methanolu, průtok 0,4 ml/min, doba analýzy 7 min, injekce 2 µl.
• Hmotnostní spektrometrie: SCIEX 5500 Triple Q s elektrosprayem v pozitivním módu, zdroj 600 °C, vysokotlaké a nízkotlaké plyny, napětí 4 000 V. Pro jednotlivé látky stanovena tranzitní iontová přechodová kvadrupólová MRM nastavení.

Hlavní výsledky a diskuse

Limit kvantifikace (LOQ) všech sloučenin byl stanoven na 0,1 ng/ml v celkové krvi. Srovnání extrakčních metod ukázalo:

• EVOLUTE EXPRESS CX s eluční směsí DCM/IPA/NH4OH poskytl nejvyšší výtěžnosti (>80 %), ale zároveň vykazoval mírně vyšší potlačení signálu (10–40 %).
• ISOLUTE SLE+ s MTBE vykazoval výtěžnosti nad 60 % a nejnižší matrixové efekty, což zajišťuje vyšší čistotu extraktu.
• Silika-podporovaná SPE (ISOLUTE HCX) s EA/ACN/NH4OH vykázala nejlepší vyváženost mezi výtěžností a minimálními matrixovými efekty.

Doba přípravy vzorku se lišila podle typu sorbentu – polymerní desky umožňovaly vynechat kondicionační a sušící kroky, čímž se šetřil čas.

Přínosy a praktické využití metody

Studie poskytuje jasná doporučení pro různé analytické scénáře:

• Pro maximální výtěžnost při méně náročném čištění je vhodné použít polymerní SPE EVOLUTE EXPRESS CX s DCM/IPA/NH4OH.
• Pro kritická klinická měření s požadavkem na minimální matrixové rušení se doporučuje SLE+ s MTBE nebo SPE s ISOLUTE HCX a EA/ACN/NH4OH.

Metody lze flexibilně aplikovat v manuálním režimu i na automatizovaných systémech Biotage Extrahera či VacMaster/PRESSURE+ manifoldech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj analytičky bude směřovat k:

• Integraci plně automatizovaných pracovních postupů pro zvýšení reproducibility a průchodnosti vzorků.
• Nasazení mikroextrakčních technik a online SPE pro rychlejší a ekologičtější přípravu.
• Rozšíření panelu cílových analýz o nové fentanylové deriváty či metabolity pomocí HRMS metod.

Závěr

Porovnání metodika ukázalo, že neexistuje univerzálně nejlepší protokol – volba závisí na požadavcích na výtěžnost, čistotu extraktu a časovou efektivitu. Studium maticových efektů a výtěžností umožňuje laboratorím vybrat optimální extrakční postup pro kvantitativní stanovení fentanyl analogů v komplexní biologické matrici.

Reference

• National Survey on Drug Use and Health, data on opioid use disorder.
• The Economic Burden of Prescription Opioid Overdose, Abuse, and Dependence in the United States. Med Care. 2016 Oct;54(10):901-6.