An In-Well Hydrolysis Solid Phase Extraction Method Using EVOLUTE® HYDRO CX for 96 Licit and Illicit Drugs of Abuse from Urine Prior to UPLC-MS/MS

Význam tématu

Rostoucí požadavky na rychlou a spolehlivou analýzu licitních a ilicitních látek v moči kladou důraz na efektivní přípravu vzorků. In-well hydrolýza spojená s pevnou fází extrakce umožňuje vysokou propustnost bez nadbytečných přenosových kroků, snižuje riziko kontaminace a zkracuje dobu analýzy před UPLC-MS/MS.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo ověřit efektivitu in-well hydrolýzy a SPE pomocí EVOLUTE HYDRO CX 96-well desek pro extrakci 96 licitních a ilicitních drog z moči a demonstrovat kompatibilitu s UPLC-MS/MS. Studie porovnala různé enzymy, parametry praní a eluce a automatizační platformy.

Použitá metodika

• Vzorky: 100 µL moči + enzymatický master mix (BGTurbo, IMCSzyme nebo komerční enzym) inkubace 55 °C/30 min.
• Předúprava: acidifikace 4 % fosforečnou kyselinou.
• SPE: EVOLUTE HYDRO CX 10 mg nebo 30 mg na jamku, formát 96-well.
• Promývání: 1 mL 4 % fosforečné kyseliny, následně 1 mL 50 : 50 metanol/voda.
• Eluce: dvojí aplikace směsi DCM/MeOH/NH4OH (78 : 20 : 2) v objemu 500–750 µL.
• Sušení: dusíkem při 40 °C.
• Rekonsititu ce: 100 µL mobilní fáze A/B (90 : 10) s 0,1 % kyselinou mravenčí, vortex.
• UPLC gradient: z 5 % na 95 % organické fáze při 0,45 mL/min.

Použitá instrumentace

• Shimadzu Nexera X2 UHPLC
• Restek Raptor Biphenyl kolona 50×3 mm, 2,7 µm, 40 °C
• Sciex Triple Quadrupole 5500, ESI pozitivní i negativní režim
• Biotage PRESSURE+ 96 a Extrahera pro automatizaci SPE
• Biotage SPE Dry 96 pro vysoušení eluátů

Hlavní výsledky a diskuse

• Výtěžky analyz v rozmezí 60–100 %, nižší u látek vázaných převážně reverzně-fázově kvůli vyššímu obsahu metanolu v praní.
• Matricové efekty většiny sloučenin pod 15 %.
• Hydrolýza závislá na typu enzymu – BGTurbo, IMCSzyme a komerční enzymy vykazovaly odlišné konverzní rychlosti.
• Automatizované postupy minimalizovaly variabilitu a dobu přípravy vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Současná příprava až 96 vzorků ve formátu 96-well.
• Eliminace přenosového kroku a zkrácení přípravy o ~30 %.
• Nižší riziko carryover díky in-well hydrolýze.
• Komplexní pokrytí licitních i ilicitních analyz vhodné pro forenzní a klinické laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Plná robotizace a online SPE-UHPLC-MS/MS integrace.
• Vývoj nových enzymatických mixů pro lepší hydrolýzu konjugátů.
• Použití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie a pokročilých datových algoritmů.
• Aplikace zásad zelené chemie s omezením organických rozpouštědel.

Závěr

In-well hydrolýza spojená s EVOLUTE HYDRO CX 96-well SPE poskytuje rychlou, robustní a vysoce průchodnou přípravu vzorků moči pro stanovení širokého spektra drog před UPLC-MS/MS s vynikajícími výtěžky, nízkými matricovými efekty a minimalizovanou kontaminací.