Determination of Human Milk Oligosaccharides in Human Breast Milk by HPAE-PAD with On-Line Sample Cleanup

Význam tématu

Lidské mléčné oligosacharidy (HMOs) představují třetí nejhojnější složku mateřského mléka po laktóze a lipidech a hrají klíčovou roli v imunomodulaci novorozence a ve formování střevního mikrobiomu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat kvantitativní metodiku pro stanovení šesti hlavních HMOs (2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tetraose a lacto-N-neotetraose) v lidském mléce s využitím HPAE-PAD bez nutnosti derivatizace vzorků a s on-line čištěním vzorků.

Použitá metodika

Metoda kombinuje vysokovýkonnou aniontovou výměnu (HPAE) s pulzní amperometrickou detekcí (PAD). Vzorek se připraví schématem “dilute-and-shoot” – naředění mléka a přímá injekce. On-line čištění zajišťuje IonPac NG1 trap kolona, která odstraňuje hydrofobní interferenty. Po analýze lze trap kolonu regenerovat 200 mM HCl v 80 % acetonitrilu.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex ICS-5000 HPAE-PAD systém
• Dionex IonPac NG1 kolona (4×35 mm) jako trap pro on-line čištění
• Thermo Scientific CarboPac PA1 analytická kolona (4×250 mm) a guard kolona (4×50 mm)

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace v rozmezí 1–100 µg/mL vykázala lineární závislost s R² > 0,999. Meze detekce (MDL) se pohybovaly mezi 4–21 µg/mL mléka a meze kvantifikace (MQL) mezi 13–68 µg/mL. Robustnost trap kolony byla prokázána více než 300 injekcemi bez ztráty signálu. Spike-and-recovery testy na kolostru a zralém mléce potvrdily přesnost 96–108 % a opakovatelnost RSD < 6 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení pracovní náročnosti díky on-line čistění vzorku
• Zvýšení analytické propustnosti a úspora času
• Odstranění nutnosti derivatizace sacharidů
• Aplikovatelnost v klinických studiích i QA/QC mléčných produktů

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit na širší spektrum HMOs, integrovat s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturální analýzu, automatizovat přípravu vzorků a aplikovat ve populačních studiích vyhodnocujících individuální variabilitu oligosacharidů.

Závěr

Navržená HPAE-PAD metoda s on-line čištěním poskytuje rychlou, přesnou a reprodukovatelnou analýzu šesti klíčových lidských mléčných oligosacharidů a je vhodná pro výzkum i rutinní kontrolu kvality mateřského a mléčných produktů.

Reference

1. Kunz C.; Rudloff S.; Baier W.; Klein N.; Strobel S. Oligosacharidy v lidském mléce: strukturní, funkční a metabolické aspekty. Annu. Rev. Nutr. 2000, 20, 699–722.
2. Zivkovic A.M.; German J.B.; Lebrilla C.B.; Mills D.A. Glykobionom lidského mléka a jeho vliv na střevní mikrobiotu novorozence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010.
3. Morrow A.L. et al. Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J. Pediatr. 2004, 145(3), 297–303.
4. Bode L. Recent Advances on Structure, Metabolism, and Function of Human Milk Oligosaccharides. J. Nutr. 2006, 136(8), 2127–2130.
5. Coppa G.V.; Gabrielli O. Human milk oligosaccharides as prebiotics. In Therapeutic Microbiology: Probiotics and Related Strategies; ASM Press, Washington, DC, 2008; s. 131–146.
6. Erney R.M. et al. Variability of human milk neutral oligosaccharides in a diverse population. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2000, 30(2), 181–192.
7. Coppa G.V. et al. Lactose, oligosaccharide and monosaccharide content of milk from mothers delivering preterm newborns over the first month of lactation. Minerva Pediatr. 1997, 49(10), 471–475.
8. Thurl S.; Müller-Werner B.; Boehm G.; Munzert M.; Stahl B.; Jelinek J. Variation of human milk oligosaccharides in relation to milk groups and lactational periods. Br. J. Nutr. 2010, 104(9), 1261–1271.
9. Thurl S.; Müller-Werner B.; Sawatzki G. Quantification of individual oligosaccharide compounds from human milk using high-pH anion-exchange chromatography. Anal. Biochem. 1996, 235(2), 202–206.