INTACT Mass™ - a Versatile waters_connect™ Application for Rapid Mass Confirmation and Purity Assessment of Biotherapeutics

Význam tématu

Intaktní hmotnostní analýza bioterapeutik prostřednictvím LC-MS představuje klíčový nástroj pro potvrzení molekulární hmotnosti, charakterizaci produktové heterogenity a monitorování přítomnosti nečistot v průběhu vývoje i komercializace léčiv. Rychlé, vysoce propustné metody jsou nezbytné pro zvládnutí velkého počtu vzorků v oborech objevného výzkumu, optimalizace procesů a stabilitních studií.

Cíle a přehled studie

Cílem předložené aplikace INTACT Mass™ v rámci platformy waters_connect™ bylo vytvořit ucelený, plně automatizovaný pracovní tok pro získávání, zpracování a reportování dat intaktní hmotnosti proteinových bioterapeutik ve vysoko-rychlostním režimu. Studie demonstruje využití aplikace pro cílené potvrzení hmotnosti a stanovení čistoty šesti komerčně dostupných monoklonálních protilátek (mAbs) a subjednotek NISTmAb po enzymatickém štěpení IdeS.

Použitá instrumentace

• LC-MS systém BioAccord™ s modulárními bloky ACQUITY Premier UPLC (BSM, FTN, komprese 80 °C)
• TUV optický detektor se sledováním při 280 nm
• ACQUITY RDa™ hmotnostní detektor (ESI, pozitivní ionizace)
• Software waters_connect™ verze 2.1.2.4 se speciální aplikací INTACT Mass™

Použitá metodika

Separační metoda využívá rychlý 2,5minutový gradient na kolóně ACQUITY Premier Protein BEH C4 (300 Å, 1,7 µm, 2,1×50 mm) v prostředí 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a acetonitrilu. Pro subjednotkovou analýzu je runtime prodloužen na 3 minuty. MS data jsou získávána v režimu Full Scan s rozsahem 400–7000 m/z, scan rate 2 Hz a aktivovanou inteligentní datovou akvizicí (IDC). V aplikaci INTACT Mass™ se automaticky optimalizují rozsahy pro dekonvoluci a parametry algoritmů MaxEnt1 nebo BayesSpray.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro šest mAb vzorků (48 injekcí, osm replik každá) byla potvrzena průměrná hmotnost s chybou ~10 ppm a standardní odchylkou <5 ppm. Workflow umožnilo paralelní zpracování až pěti nenadřazených špiček současně a poskytlo reporty obsahující TIC a UV chromatogramy, dekonvoluovaná spektra a kvantitativní údaje o čistotě. Subjednotková analýza NISTmAb po IdeS štěpení zobrazila oddělené špičky scFc, lehkého řetězce a Fd fragmentu s průměrnou chybou hmotnosti ~5 ppm a celkovou čistotou 99,1 %.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace chromatografické detekce a dekonvoluce umožňuje laboratorím snadno implementovat platformní metody pro širokou škálu biomolekul. Rychlý cyklus sběru a zpracování dat zkracuje dobu analýzy stovek vzorků, což je výhodné jak ve výzkumných institucích, tak v komerčních QA/QC laboratořích v regulovaných prostředích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace umělé inteligence pro prediktivní optimalizaci dekonvolučních parametrů
• Rozšíření knihoven modifikací pro méně standardní biomolekulární třídy
• Propojení s LIMS a dalšími podnikovými informačními systémy pro plně digitální workflow
• Zvýšení rozlišení a citlivosti MS detekce pro sledování nízkoabundantních variant

Závěr

Aplikace INTACT Mass™ v platformě waters_connect™ představuje komplexní, vysoce propustné řešení pro potvrzení intaktní hmotnosti a stanovení čistoty bioterapeutik. Umožňuje rychlé nasazení v regulovaných provozech i ve vývojových laboratořích a zajišťuje reprodukovatelné výsledky s nízkou chybou hmotnosti.

Reference

1. Ferrige A., et al. “Disentangling Electrospray Spectra with Maximum Entropy.” Rapid Commun. Mass Spectrom., 6 (1992): 707–711.
2. Skilling J., et al. “Beyond MaxEnt Deconvolution.” Waters Poster 720003756 (2010).
3. Berger S., Boyce P. “Beyond INTACT Mass Application within waters_connect.” Waters Vlog (2022).
4. Doneanu C., et al. “LC-MS Analysis of Single Guide RNA Impurities Using the BioAccord System with ACQUITY Premier and Automated waters_connect INTACT Mass Application.” Waters Application Note 720007546 (2022).