LC/Q-TOF Marker Identification to TQ LC/MS Targeted Quantitation

Význam tématu

Potravinová alergie na arašídy patří k nejčastějším a může vést k život ohrožujícím reakcím. Přesné stanovení obsahu arašídových alergenů ve zpracovaných výrobcích a surovinách je proto klíčové pro ochranu alergických konzumentů a pro splnění požadavků potravinářských regulací. Metody založené na ELISA často vykazují variabilitu a omezenou citlivost, zejména po tepelném zpracování potravin.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat workflow kombinující LC/Q-TOF screening markerů a následnou cílenou kvantifikaci na triple kvadrupólu (TQ LC/MS). Auto MS/MS analýza na Agilent 6545 Q-TOF pomohla identifikovat robustní peptidové markery z tryptického štěpu arašídových proteinů. Vybrané peptidy byly následně optimalizovány pro MRM na Agilent 6470 TQ LC/MS za účelem spolehlivého stanovení obsahu arašídového proteinu Ara h 1 ve třech různých matricích (syrová mouka, mouka se směsí hydrogenované sójové oleje a s přídavkem soli), a to jak v syrovém, tak ve vařeném stavu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC se sekvenčním pumpním modulem
• Agilent 6545 Q-TOF s Auto MS/MS režimem
• Agilent AdvanceBio Peptide Mapping analytická kolona (2.1×100 mm, 2.7 μm)
• Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS se MRM (MassHunter Optimizer for Peptides)

Použitá metodika

1. Příprava vzorku: Extrakce peptidů trypsinem z 0.5 g sušené moučné matrice, následná srážka velkých proteinů a SPE čistění na Bond Elute Plexa kolóně.
2. LC/Q-TOF screening: Automatizovaná Auto MS/MS analýza, vyhledání známých arašídových peptidů v MassHunter Qualitative Analysis, výběr 11 kandidátních markerů.
3. MRM optimalizace: Použití syntetických přírodních a izotopově značených peptidů, automatické nastavení přechodů, fragmentoru a kolizního napětí v MassHunter Optimizeru.
4. Kvantifikace TQ LC/MS: Analýza maticových standardů Ara h 1 pro stanovení linearity a LOQ, stanovení recovery, přesnosti, opakovatelnosti a reprodukovatelnosti v syrových i kouřených vzorcích.

Hlavní výsledky a diskuse

• LOQ metody dosáhla 0.31 mg/kg celkového arašídu, překračující citlivost běžných ELISA souprav (1–2.5 mg/kg).
• Lineární oblast stanovení pokrývala 0.31–40 mg/kg s R2>0.99.
• Recovery v rozsahu 80–120 % pro sady vzorků se snadnou přípravou i po tepelném zpracování.
• Přesnost kvantifikace (accuracy) v jednotlivých matricích se odchylovala maximálně o 20 % od nominální hodnoty, což odpovídá rozdílům v obsahu Ara h 1 (12–16 % proteinové frakce).
• Opakovatelnost a reprodukovatelnost dosahovaly RSD 2–15 % mezi dávkami a dny analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vyšší citlivost, širší lineární rozsah a robustnost vůči matrix efektům než tradiční ELISA. Díky kombinaci Q-TOF screeningové fáze a cílené MRM analýze je workflow univerzální pro rychlé uvedení nových markerů a dalších alergenů. Vhodné pro rutinní kontrolu kvality, regulace alergenního přídatku a validaci čisticích postupů v potravinářském průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na současně detekci více alergenů díky multiplexní MRM metodě.
• Využití HR-MS screeningových instrumentů k objevování nových peptidových markerů i nekonvenčních matric.
• Integrace procesní automatizace a dálkového monitoringu citlivých QC laboratoří.
• Kombinace s metabolomickými přístupy pro komplexní profilování složení potravinových výrobků.

Závěr

Navržené workflow LC/Q-TOF marker identification → TQ LC/MS targeted quantitation umožňuje citlivé a přesné stanovení arašídových alergenů i v tepelně upravených moučných matricích. Optimalizovaný postup překonává omezení ELISA, nabízí vynikající reprodukovatelnost a může být aplikován i pro další potravinové alergeny a složité matice.

Reference

1. Poms R.E.; Anklam E.; Kuhn M.; Methods for Allergen Analysis in Food: A Review; Food Addit. Contam. 2004, 21(1), 1–31.
2. Fu T.J.; Abbott U.R.; Hatzos C.; Impact of Thermal Processing on ELISA Detection of Peanut Allergens; J. Agric. Food Chem. 2013, 61(24), 5649–5658.
3. Koch P. et al.; Comparison of Commercially Available ELISA Kits with Human Sera-Based Detection Methods for Peanut Allergens in Foods; Food Addit. Contam. 2003, 20(9), 797–803.
4. Poms R.E. et al.; Inter-Laboratory Validation Study of Five Commercial ELISA Test Kits for the Determination of Peanut Proteins in Biscuits and Dark Chocolate; Food Addit. Contam. 2005, 22(2), 104–112.
5. Jayasena S. et al.; Comparison of Six Commercial ELISA Kits for Their Specificity and Sensitivity in Detecting Different Major Peanut Allergens; J. Agric. Food Chem. 2015, 63(6), 1849–1855.
6. Bignardi C. et al.; Particle-Packed Column Versus Silica-Based Monolithic Column for LC-ESI-LIT-MS Multiallergen Trace Analysis in Foods; J. Chromatogr. A 2010, 1217(48), 7579–7585.
7. Heick J. et al.; LC-MS/MS Method for the Simultaneous Detection of Seven Allergenic Foods in Flour and Bread; J. AOAC Int. 2011a, 94(4), 1060–1068.
8. Heick J. et al.; First Screening Method for the Simultaneous Detection of Seven Allergens by LC-MS; J. Chromatogr. A 2011b, 1218(7), 938–943.
9. Monaci L. et al.; HR-Orbitrap MS for Rapid Detection of Peanuts in Nuts; Food Addit. Contam. A 2015, 32(10), 1607–1616.
10. Planque M. et al.; Advances in UHPLC-MS/MS for Sensitive Detection of Food Allergens; J. Chromatogr. A 2016, 1464, 115–123.
11. Pilolli R. et al.; House Validation of an HR-Orbitrap Method for Multiple Allergen Detection; Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(22), 5653–5662.
12. Parker C.H. et al.; Multi-Allergen Quantitation and Impact of Thermal Treatment by ELISA and LC-MS/MS; J. Agric. Food Chem. 2015, 63(49), 10669–10680.
13. Boo C.C. et al.; Targeted LC-MS/MS Method for Egg, Milk and Peanut Allergens in Cookies; J. AOAC Int. 2018, 101(1), 108–117.
14. Daly M. et al.; Assessing Almond and Peanut Allergens Using ELISA and LC-MS/MS; J. AOAC Int. 2018, 101(1), 96–101.
15. New L.S. et al.; Simultaneous Analysis of Multiple Allergens by LC-MS/MS; J. AOAC Int. 2018, 101(1), 132–145.
16. Sayers R.L. et al.; Microfluidic Separation Coupled to MS for Peanut Allergens; J. Proteome Res. 2018, 17(1), 647–655.
17. Chang Y. et al.; Simplified, Sensitive and Accurate LC-MS/MS Method for Peanut Quantification in Wheat Flour-Based Matrices; Food Addit. Contam. A 2021, 38(8), 1260–1272.
18. Shefcheck K.J. et al.; Confirmation of Peanut Protein Using Peptide Markers in Dark Chocolate; J. Agric. Food Chem. 2006, 54(21), 7953–7959.
19. New L.S. et al.; Detection and Quantitation of Selected Food Allergens by LC-MS/MS; J. AOAC Int. 2020, 103(2), 570–583.
20. Sayers R.L. et al.; Effect of Thermal Processing on Peanut Allergen Peptide Targets; Analyst 2016, 141(13), 4130–4141.
21. Sealey-Voyksner J. et al.; Discovery of Conserved Peanut and Tree Nut Peptides by LC-MS/MS; Food Chem. 2016, 194, 201–211.
22. Careri M. et al.; Peptide Biomarkers for Quantitative Confirmation of Ara h2 and Ara h3/4 in Foods by LC-MS/MS; Anal. Bioanal. Chem. 2007, 389(6), 1901–1907.
23. Pedreschi R. et al.; Challenges in Detecting Food Allergens by Proteomics: Case Study on Peanut in Cookies; Nutrients 2012, 4(2), 132–150.
24. Shefcheck K.J. et al.; Confirmation of Ara h1 in a Model Food Matrix Using LC-MS/MS; J. Agric. Food Chem. 2004, 52(10), 2785–2790.
25. Faeste C.K. et al.; LC-MS in Food Allergen Detection; J. Food Prot. 2011, 74(2), 316–345.
26. Commission Decision 2002/657/EC implementing Directive 96/23/EC concerning performance of analytical methods (OJ L 221, 17.08.2002, p. 8).