Thermo Scientific HILIC Separations Technical Guide

Význam tématu

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) představuje klíčovou metodu pro rozdělení a analýzu vysoce polárních sloučenin, které jsou obtížně zadržovány v konvenčním obráceném fázovém režimu. Díky vysokému podílu organického rozpouštědla v mobilní fázi usnadňuje HILIC propojení s hmotnostní spektrometrií a zlepšuje citlivost měření. Metoda nachází uplatnění v oborech farmacie, klinické chemii, metabolomice, proteomice, glykomice, potravinářství a biotechnologiích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem „Practical Guide to HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting“ je:

• Poskytnout přehled historického vývoje a principů zadržení ve HILIC.
• Ukázat různé typy stacionárních fází a jejich selektivitu.
• Nabídnout postupy pro vývoj metod, optimalizaci podmínek a řešení problémů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodické postupy zahrnují isokratické i gradientní eluce s organickým podílem 60–97 % (akronitril), vodná složka obsahuje 3–40 % pufru (5–20 mM amoniakální formiát/acetát, pH 3–7). Doporučeno dlouhé (100–150 mm) nebo krátké (50–100 mm) kolony s průměrem 4,6 nebo 2,1 mm a částicemi 1,7–5 μm (plně porézní i pevné jádro). Teplota kolony 20–70 °C, optimální přenosová účinnost (van Deemter) závisí na chemii fáze.

Použitá instrumentace

• Vysokotlaké kapalinové chromatografy se 2 až 4 čerpadly pro gradient.
• Kolony Thermo Scientific (Hypersil GOLD HILIC, Accucore HILIC, Syncronis HILIC, amidové, urea a jiné stacionární fáze).
• Detektory UV (200–300 nm), fluorescenční, CAD a hmotnostní spektrometry s elektrosprenkovou ionizací (ESI-MS, tandem MS/MS).
• Systémy na automatické podávání vzorků a SPE předkolony.

Hlavní výsledky a diskuse

Mechanismy zadržení spočívají v rozdělování polárních analyzátů do vodou nasycené vrstvy na pórech stacionární fáze, doplněném vodíkovým vázáním a elektrostatickými interakcemi. Na základě rozsáhlé literatury a experimentálního testování bylo sestaveno osm osé hodnocení (hydrofobicita, hydrofilita, izomerická selektivita, aniontový/kationtový výměník, kyselý/základní charakter fáze, absolutní retenční faktor k):

• Nejběžnější fází je neošetřená či hybridní silika (35 % aplikací), následují amidové (14 %), cyjanopropylové (25 %), diolové (9 %), aminopropylové (4 %), zvířecí (12 %) a další (1 %).
• Výhody HILIC oproti RPLC: retrospektivní pořadí eluce, vysoká retence polárních sloučenin, nižší viskozita, nižší tlak, lepší S/N v MS (příklady: nikotin +15krát, kotinin +5krát), kompatibilita s tvorbou kolumnové fokuse.
• Omezení zahrnují dlouhou časovou stabilizaci kolony, obtížné měření pH v organických systémech, špatný tvar špiček při nesouladu vzorek/rozpouštědlo.
• Vývoj metody: volba skupiny fáze podle ionizačního stavu analyzátu (kyseliny, báze, neutrální), stanovení počátečního % ACN, pH, koncentrace pufru, maximalizace rozlišení drobnými kroky změn (1–5 % organika, 2,5 mM pufr, pH upravit dle pKa). Důkladné opětovné vyrovnání řádově 20 objemů kolony.

Přínosy a praktické využití metody

HILIC je široce používaná v:

• Farmaceutickém výzkumu (retence polárních látek, degradace léčiv, metabolity).
• Klinické chemii a terapeutickém monitoringu (polarické biomarkery, neurotransmitery).
• Metabolomice a proteomice (komplexní profily malých metabolitů, glykokonjugáty).
• Potravinářství a environmentální analýze (pesticidy, vitaminy, kyseliny).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových stacionárních fází s vyšší selektivitou a nižšími sekundárními interakcemi.
• Automatizace optimalizace metod pomocí umělé inteligence a pokročilého návrhu experimentů (DOE).
• Rozšíření aplikací v mikro/kapilární HILIC,
  dvourozměrných LC × LC systémech a spojení s vysokorozlišovacími MS detektory.
• Non-aqueous HILIC pro extrémně polární a nízkomolekulární látky v nevodných systémech.

Závěr

HILIC představuje doplňkovou a často nezbytnou separační techniku k RPLC pro polární sloučeniny. Úspěch metody závisí na vhodném výběru stacionární fáze, optimalizaci poměru organika/vody, pH a pufru. Správné vyrovnání kolony a kontrola parametrů přináší vysoce reprodukovatelné a citlivé analýzy.

Reference

1. Hemström P., Irgum K. Hydrophilic Interaction Chromatography. J. Sep. Sci. 2006, 29, 1784.
2. Gregor H.P., Collins F.C., Pope M. Indication of water-enriched layer. J. Colloid Sci. 1951, 6, 304.
3. Samuelson O., Sjöström E. Ion-exchange separation of monosacharidů. Sven. Kem. Tidskr. 1952, 64, 305.
4. Rückert H., Samuelson O. Vrstvy vody na ion-exchange. Sven. Kem. Tidskr. 1954, 66, 337.
5. Linden J.C., Lawhead C.L. Analýza cukrů na amino kolonách. J. Chromatogr. 1975, 105, 125.
6. Palmer J.K. Chromatografická separace sacharidů. Anal. Lett. 1975, 8, 215.
7. Alpert A.J. Pojmenování HILIC. J. Chromatogr. 1990, 499, 17.
8. Guo Y., Gaiki S. Electrostatic interactions in HILIC. J. Chromatogr. A 2011, 1218, 5920.
9. Alpert A.J. „Reversed reversed-phase“. Anal. Chem. 2008, 80, 62.
10. Jiang W. et al. Zwitterion fáze pro HILIC. J. Chromatogr. A 2006, 1127, 82.
11. Ikegami T. et al. Aminopropyl vs amide fáze. J. Chromatogr. A 2008, 1184, 474.
12. Pontén E. HILIC trendy. LCGC Europe 2012.
13. McCalley D.V. Kinetika HILIC. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 3408.
14. Ruta J. et al. Komplementarita RPLC–HILIC. J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 63, 95.
15. Periat A. et al. Organické modifikátory v HILIC. J. Chromatogr. A 2013, 1282, 72.
16. Gritti F. et al. Kolonové přetížení v PALC vs HILIC. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 683.
17. Jandera P. Review HILIC. Anal. Chim. Acta 2011, 692, 1.
18. Johnson J.R. et al. Dvojité smyčky vzorku. Anal. Chim. Acta 2010, 678, 117.
19. McCalley D.V. pH v organicích mobilech. J. Chromatogr. A 2007, 1171, 46.
20. Kawachi Y. et al. Radarové grafy pro HILIC fáze. J. Chromatogr. A 2011, 1218, 5903.
21. Kimata K. et al. Struktura selektivity. J. Chromatogr. Sci. 1989, 27, 721.
22. Liu M. et al. Neaqueous HILIC. J. Chromatogr. A 2009, 1216, 2362.
23. Li R., Huang J. Kompetice alkoholu. J. Chromatogr. A 2004, 1041, 163.
24. Bicker W. et al. Proteomika a HILIC. J. Sep. Sci. 2008, 31, 2971.
25. Dell’Aversano C. et al. PALC vs HILIC špičky. J. Chromatogr. A 2005, 1081, 190.
26. Chirita R.-I. et al. Silanol interakce. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 3091.
27. Guo Y., Gaiki S. Vývoj metod HILIC. J. Chromatogr. A 2005, 1074, 71.