Fast profiling of the N-glycan population in biotherapeutic antibodies by UHPLC-FLD with MS confirmation

Význam tématu

Glykosylace hraje klíčovou roli v biologické aktivitě a kvalitě monoklonálních protilátek. Přesné stanovení profilu N-glykanů je nezbytné pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a shody s regulačními normami (ICH Q5E Q6B, USP 129). Rychlá a robustní analytika glykoform přispívá k vývoji biosimilars, kontrole jakosti a klinické diagnostice.

Cíle a přehled studie / článku

• Vyvinout univerzální UHPLC FLD metodu pro rychlou a komplexní profilaci 2 AA a 2 AB značených N glykanů v IgG protilátkách
• Validovat metodiku na humánní sérum IgG a komerční chimerickou IgG1 mAb (infliximab)
• Potvrdit glykanové profily pomocí exoglykozidázových enzymatických štěpení a vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie HRAMS MS
• Zvýšit průchodnost a zkrátit dobu analýzy optimalizací kolony a gradientu

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje enzymatické uvolnění N glykanů pomocí PNGase F, označení fluoroforem 2 AA nebo 2 AB, očistu HILIC SPE a chromatografickou separaci HILIC módem. Strukturální potvrzení proběhlo exoglykozidázovými digesty (ABS, BKF, SPG, GUH) a HRAMS MS.

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC FLD
• Accucore 150 Amide HILIC kolony (2.1×250 mm, 2.1×150 mm, 2.1×50 mm)
• Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole Orbitrap MS
• Thermo Scientific SpeedVac Concentrator
• Centrifugační filtry 10 kDa, PCR inkubátor

Hlavní výsledky a diskuse

• Humánní sérum IgG: detekováno 18 rozlišených glykanů s biantennárními strukturami, variabilní fukózou, galaktózou, bisekcí a nízkou úrovní sialylace.
• Komerční infliximab: identifikováno 24 chromatografických vrcholů a 38 odlišných glykoform díky kombinaci UHPLC FLD a HRAMS. Struktury potvrzeny sekvenčními exoglykozidázovými digesty.
• Zkrácení délky kolony z 250 mm na 150 a 50 mm umožnilo zkrácení doby analýzy na 15 minut při přijatelné ztrátě rozlišení.
• Exoglykozidázové štěpení ukázalo selektivity enzymů: ABS odstraňuje sialové kyseliny, BKF fukózu, SPG galaktózu a GUH GlcNAc.
• HRAMS poskytla přesné molární hmotnosti a jednoznačnou identifikaci oligosacharidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a reproducibilita umožňují detekci minoritních glykoform.
• Rychlá analýza zkracuje dobu kontroly jakosti v bioprocesu.
• Metoda je vhodná pro rutinní monitoring biosimilars, QA QC laboratoře a vývoj nové generace bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a multiplexní vysokopropustné formáty pro screening velkého počtu vzorků.
• Integrace s automatizovanými platformami a on-line hyphenace s MS MS pro detailní studium isomerů.
• Využití strojového učení pro rychlou interpretaci glykoformových profilů a predikci biologické aktivity.

Závěr

Představený workflow kombinuje UHPLC FLD a HRAMS pro rychlou, citlivou a spolehlivou analýzu N glykanů v monoklonálních protilátkách. Metoda nabízí vysokou průchodnost, detailní strukturovou charakterizaci a splňuje požadavky moderního QA QC v biotechnologickém průmyslu.

Reference

• Jenkins N, Murphy L, Tyther R. Post-translational Modifications of recombinant proteins: significance for Biopharmaceuticals. Mol Biotechnol. 2008;39:113-118.
• Costa AR, Rodrigues ME, Henriques M, Oliveira R, Azeredo J. Glycosylation: impact, control and improvement during therapeutic protein production. Crit Rev Biotechnol. 2014;34:281-299.
• Jefferis R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2009;8:226-234.
• Reusch D, Tejada ML. Fc glycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes. Glycobiology. 2015;25(12):1325-1334.
• European Medicines Agency. Guideline on Development, Production, Characterization and Specifications for Monoclonal Antibodies and Related Products. EMEA CHMP BWP 157653 2007. 2008.
• ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological Biological Products. 1999.
• Hunziker H. Genetic defects in the human glycome. Nat Rev Genet. 2006;7:537-551.
• Adamczyk B, Tharmalingam T, Rudd PM. Glycans as cancer biomarkers. Biochim Biophys Acta. 2012;1820:1347-1353.