Trifluoroacetic acid performance of the Vanquish Flex Binary UHPLC system

Význam tématu

Trifluoroctová kyselina je nejčastěji používaným iontovým párovacím činidlem v reverzní fázi UHPLC při separaci peptidů a proteinů. Snižuje pH mobilní fáze a upravuje interakci analytů se stacionární fází, což zlepšuje selektivitu. Současně však silně pohlcuje UV záření pod 250 nm a je retinovaná na RP kolonech, což vede k výrazným baseline ripplům během gradientní eluční metody a omezuje detekční citlivost a limit detekce analytů.

Cíle a přehled studie

Cílem technické studie bylo srovnat výkon nové Vanquish Flex Binary UHPLC soustavy s osvědčenou UltiMate 3000 Binary RS ve vztahu k baseline rušení vyvolanému TFA. Analýza se zaměřila na tři klíčové parametry pumpy, které ovlivňují stabilitu mobilní fáze: velikost mixeru, objem zdvihu pístu a konzistenci průtoku. Účelem bylo minimalizovat baseline ripples při zachování nízké gradientní zpoždění a vysoké propustnosti.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex Binary UHPLC system obsahující System Base, Binary Pump F, Split Sampler FT, Column Compartment H, Diode Array Detector HL a LightPipe flow cell 10 mm
• UltiMate 3000 Binary RS system se Solvent Rack s degaserem SRD 3600, Binary High Pressure Gradient Pump HPG 3400RS, autosampler WPS 3000TRS, DAD 3000RS a semi mikro flow cell 7 mm
• Řídicí software Chromeleon CDS verze 7.2 SR4
• Kolona Accucore C18 2.6 µm 2.1×100 mm, eluenty voda s 01 procentem TFA a acetonitril s 0085 procentem TFA

Metodika

Gradientní metodu tvořilo lineární zvýšení podílu acetonitrilu z 5 na 55 procent za 30 minut při průtoku 06 mL min a tlaku 300 až 450 bar. Start bylo 5 procent B, přechod na 100 procent B následuje rychleji, s návratem na 5 procent B po ukončení hlavního gradientu. Teplota kolony 25 °C, objem injekce 1 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání baseline ukázalo u UltiMate 3000 Binary RS při mixeru 400 µL průměrnou amplitudu ripplů 017 mAU, zatímco Vanquish Flex Binary díky novému algoritmu řízení průtoku dosáhl pouhých 008 mAU. Zvýšení mixeru z 200 na 400 µL snižuje, avšak neodstraňuje fluktuace způsobené objemovými periodami solventů. Simulace redukovaného objemu zdvihu pístu rozdělením průtoku solventu B přinesla výrazné snížení periodických odstřelů, ale finální odstranění šumu umožnilo především inteligentní řízení zpětného tlaku a kompenzace termálních efektů ve válci pumpy.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace nové řídicí logiky pumpy eliminuje nutnost zvětšených mixerů a zachovává nízké GDV, což vede ke zkrácení doby analýzy a vyšší vzorkové průchodnosti. Nižší baseline šum výrazně snižuje limit detekce pro peptidy a proteiny, zvyšuje spolehlivost kvantifikace a usnadňuje detekci stopových nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj pokročilých algoritmů řízení průtoku a kompenzace fyzikálně chemických vlastností organických elučních složek. Možnosti integrace přímých hmotnostně spektrometrických detektorů a adaptivních systémů pro různá iontová párovadla otevírají prostor pro univerzální řešení v proteomice a QC v průmyslu.

Závěr

Vanquish Flex Binary UHPLC systém s novým pump control algoritmem minimalizuje baseline ripples vyvolané TFA a zároveň zachovává nízké gradientní zpoždění bez nutnosti velkých mixerů. Výsledkem je vyšší citlivost, lepší opakovatelnost analýz a vyšší propustnost laboratoří.

Reference

1. Thermo Scientific Technical Note 108 Reliable Solvent Mixing in UHPLC LPN2851 EN
2. Winkler G LCGC 1987 5 12 1044–1045
3. Thermo Scientific Poster Note 64807 UHPLC Optimization Study for Improved LC MS Performance and Throughput PN64807 EN
4. Choikhet K Glatz B Rozing G LC GC Europe 2003