Fluorescence Method Development Handbook

Význam tématu

Fluorescenční detekce představuje nejcitlivější optickou metodu v kapalinové chromatografii, zásadní pro detekci stopových látek s vysokou selektivitou a nízkým šumem. Uplatňuje se v analýze přírodních fluoroforů i v chemických derivačních reakcích, např. při stanovení aminokyselin. Optimalizace metody významně zlepšuje limity detekce, robustnost a univerzálnost stanovení v rozličných oblastech od farmacie až po environmentální analýzu.

Cíle a přehled studie

Účelem příručky je detailně popsat kroky vývoje a optimalizace fluorescenční detekce na přístrojích Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 FLD-3000 a Vanquish FLD. Autoři demonstrují: rozbor literatury pro výběr kolony a pohyblivé fáze, volbu detekčních režimů (zero order, synchronní skeny, emisní a excitační skeny), nastavení optických filtrů a zesílení PMT, řízení datové sběru i inteligentní využití xenonové výbojky.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf UHPLC/HPLC Thermo Scientific UltiMate 3000 nebo Vanquish
• Fluorescenční detektor FLD-3000 (UltiMate 3000) či Vanquish FL Detectors (FLD-3100, FLD-3400RS) s xenonovou flash lampou a jednou či dvěma PMT
• Chromeleon™ 7 CDS pro řízení skenů, datovou akvizici a optimalizační nástroje
• Kolona Thermo Scientific Acclaim RSLC 120 C18, 2,2 µm, 3 × 100 mm
• Pohyblivé fáze: voda Optima™ LC/MS a acetonitril Optima™ LC/MS

Použitá metodika

1. Literární rešerše – určení pravděpodobných excitačních a emisních maxim analyzátů podle UV absorpčního spektra a dostupných studií.
2. Počáteční experimenty – zero order režim a synchronní skeny pro rychlé stanovení retenčních časů i hrubých maxima bez nutnosti DAD.
3. Emisní a excitační FL Field – získání 3D spektroskopických map pro přesnou volbu nejvyšší odezvy (Stokesův posun 20–30 nm).
4. Variabilní emisní filtr – automatická volba nejvhodnějšího long-pass filtru (280, 370, 435, 530 nm) pro potlačení vyšších difrakčních řádů.
5. Nastavení citlivosti PMT (Sensitivity) – optimalizace S/N pomocí parametrů MaxPMTSaturation a ClearMaxPMTSaturation; doporučená saturace 30–80 %.
6. Datová četnost a odezva – nastavení datové sběrné frekvence (DCR) a časové konstanty (response time) tak, aby byl pik definován 20–30 body; Chromeleon CDS doporučí vhodné hodnoty.
7. Xenonová flash lampa – volba režimu HighPower (300 Hz) pro nejlepší S/N, Standard (100 Hz) a LongLife (20 Hz) pro zvýšení životnosti, případně automatická změna režimu v průběhu běhu („smart use“).
8. Test kvality eluentu – porovnání pozadí fluorescence tří druhů vody (laboratorní, LC/MS třídy, deionizovaná) pro každou analyzovanou vlnovou kombinaci bez autoleveling.

Hlavní výsledky a diskuse

Na standardní směsi pěti polycyklických aromátů (PAH) bylo dosaženo:

• Optimální excitation/emission páry: např. naphthalene Ex 219 nm/Em 330 nm, anthracene Ex 247 nm/Em 400 nm, fluoranthene Ex 232 nm/Em 443 nm, pyrene Ex 238 nm/Em 390 nm, dibenzo(a,h)anthracene Ex 294 nm/Em 396 nm.
• Citlivost PMT nastavena mezi 3–6 dle analyzátu se saturací 30–70 %.
• DCR 20 Hz a response time 0,4 s vyhovují šířkám UHPLC piků.
• „Smart use“ lampy prodlužuje její životnost o 100 % bez ztráty kvality dat.
• Automatický emisní filtr účinně potlačuje difrakční artefakty i při střídání Ex. vlnových délek.

Přínosy a praktické využití metody

Metodika nabízí systematický postup pro rychlé i detailní nastavení fluorescenční detekce v různých chromatografických platformách. Umožňuje zkrátit vývoj nových aplikačních metod, zjednodušit validaci a zvýšit reprodukovatelnost výsledků v QA/QC laboratořích i výzkumných projektech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých datových nástrojů a strojového učení pro automatickou optimalizaci detekčních podmínek.
• Rozšíření detekce do viditelného a NIR rozsahu díky konfiguraci Dual-PMT.
• Miniazurizace optických detektorů a integrace s mikrofluidickými systémy pro on-line sledování reakcí.
• Vývoj nových fluorescenčních značek s posunem emisního maxima pro multiplexní analýzy.

Závěr

Příručka poskytuje komplexní a praktický soubor postupů pro vývoj a optimalizaci fluorescenční detekce v HPLC/UHPLC. Díky modulárním krokům – od literární rešerše až po automatické řízení lampy a filtrů – lze metodu snadno adaptovat na široké spektrum analyzů i zaškolit nová laboratoř k dosažení vysoké výkonnosti měření.

Reference

1. Thermo Fisher Scientific Technical Note 107: Automated In-Needle Derivatization..., LPN2849-EN, 2011.
2. Pickering MV. Ion-Exchange Chromatography of Free Amino Acids, LC-GC 1989, 7(6):484–490.
3. Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. Practical HPLC Method Development, 2nd ed.; Wiley, 1997.
4. Thermo Fisher Scientific Technical Note 92: Combining Fluorescence Detection with UHPLC, LPN2716, 2011.
5. Kasha M. Characterization of Electronic Transitions in Complex Molecules, Disc Faraday Soc 1950, 9:14–19.
6. Franz H, Manka A. TN 166: Fast and Easy Optimization of Detection Wavelengths with Vanquish FL Detectors, TN71677-EN, 2015.
7. Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed.; Springer, 2006.
8. Neubauer M, Franz H. TN 140: Optimizing and Monitoring Solvent Quality for UV-Vis, Fluorescence, and CAD, TN70818, 2014.