Vitamin D biomarkers in plasma

Význam tématu

Plazmatické biomarkery vitaminu D, konkrétně 25-hydroxyvitamin D2 a D3, jsou klíčové pro hodnocení stavu vitaminu D v klinických studiích a diagnostice. Úroveň 25(OH)D odráží zásoby vitaminu ve tkáních i expozici slunečnímu záření a je zásadní pro prevenci metabolických onemocnění kostí, jako jsou rachitida či osteoporóza.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem je vyvinout a validovat rychlou, citlivou a reprodukovatelnou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě. Metoda kombinuje inovativní pevnou fázi extrakce SOLA™ HRP s Vanquish™ Horizon UHPLC systémem a TSQ Quantiva™ tandemovou hmotnostní spektrometrií.

Použitá metodika a instrumentace

Extrakce vzorku:

• Pevná fáze extrakce SOLA HRP 30 mg/2 mL (96 jamková destička)
• Denaturace plazmatických proteinů acetonitrilem (1:1) pro uvolnění navázaných sloučenin
• Mycí fáze 60 % voda/40 % methanol, eluční fáze 100 % methanol

Chromatografie:

• Vanquish Horizon UHPLC systém (binary pump, split sampler HT, column compartment)
• Hypersil GOLD C18 VANQUISH™ 1,9 µm, 2,1 × 50 mm
• Gradient acetonitril–voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, průtok 0,8 mL/min, teplota 40 °C, doba analýzy 7,6 min

Detekce MS/MS:

• TSQ Quantiva™ triple quadrupole s HESI-II zdrojem, pozitivní ionizace
• MRM přechody: 383,2→365,3 & 211,2 m/z (OH-Vit D3), 395,4→269,2 & 209,1 m/z (OH-Vit D2), interní standard 388,4→370,3 m/z
• Nastavené parametry: spray voltage 3500 V, vaporizer 460 °C, ion transfer 368 °C, CID tlak 1,5 mTorr

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsah a citlivost:

• 25-hydroxyvitamin D2: 5–1000 ng/mL, LLOQ 5 ng/mL; 25-hydroxyvitamin D3: 2,5–1000 ng/mL, LLOQ 2,5 ng/mL
• Regresní modely s R2 > 0,99, vážení 1/x2

Přesnost a preciznost:

• Bias < ± 8,2 % a CV < 9,6 % pro všechny QC úrovně

Recovery a matrix efekt:

• Průměrné recovery 100,2 % (D2) a 101,2 % (D3)
• Internal standard normalizovaný matrix faktor 0,961 (D2) a 1,08 (D3)

Carryover:

• Bez detekovatelného carryover po injekci ULOQ

Kapacita sorbentu:

• SOLA HRP 30 mg umožňuje větší objem plazmy (1 mL) bez průniku analytu a se zvýšenou signálovou intenzitou oproti 10 mg

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost pro klinický i výzkumný monitoring vitaminu D
• Rychlá a reprodukovatelná příprava vzorku s nízkými nároky na rozpouštědla
• Vysoká propustnost analytické laboratoře díky 96-jamkové destičce a automatizaci

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další metabolity vitaminu D (např. 1,25(OH)2D)
• Další automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro zvýšení throughput
• Integrace do multiplexních bioanalytických protokolů pro komplexní profilování lipidů a vitaminů

Závěr

Navržená metodika spojuje inovativní SOLA HRP SPE a Vanquish Horizon UHPLC-MS/MS platformu pro spolehlivou a citlivou kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě. Metoda nabízí vysokou přesnost, preciznost a throughput, což ji činí vhodnou pro klinický výzkum, rutinní testování i QA/QC procesy.

Reference

• Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA a kol. Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 2011;96(7):1911–30.
• Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes for Calcium and Vitamin D. Washington, DC: National Academy Press; 2010.