Study of Effective Parameters for Separation of Isomers of Fluorescent Substance by Supercritical Fluid Chromatography

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá detekce stopových množství nádorových markerů v lidském těle je klíčová pro včasnou diagnostiku rakoviny. Fluorescenční sondy na bázi rhodaminu a fluoresceinu představují citlivé nástroje, avšak při jejich syntéze vznikají izomery střídajících se substitučních pozic. Optimalizace separace těchto izomerů je nezbytná pro zajištění selektivity a reprodukovatelnosti analytických metod v biomedicínském výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a popsat metodiku superkritické fluidní chromatografie (SFC) pro účinné rozlišení čtyř izomerů karboxytetramethylrhodaminu a jeho demethylovaných derivátů. Práce zahrnovala systematické skautování kolón, modifierů, teploty, tlaku a průtoku mobilní fáze s důrazem na optimalizaci separačního výkonu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika SFC byla založena na přístroji Nexera UC se superkritickým CO₂ a organickými modifikátory (metanol, ethanol, isopropanol) s přídavkem TFA či jiné kyseliny. Separace probíhala gradientně i izokraticky na kolonách (250×4,6 mm, 5 µm) se stacionárními fázemi:

• Silica (Shim-pack UC-Sil)
• Octadecyl + polar. funkční skupiny (UC-RP)
• Cholesteryl (UC-Choles)
• Pyrenylethyl (UC-PyE)
• Pentabrombenzyl (UC-PBr)
• Diol (UC-Diol)

Detekce probíhala foto-diodovým polem (PDA, 190–600 nm, chromatogram při 550 nm) a hmotnostním spektrometrem LCMS-8060 v režimu ESI (m/z 400–500).

Hlavní výsledky a diskuse

• Nejlepší separace čtyř špiček (dvou demethylovaných derivátů a dvou hlavních izomerů) byla dosažena na silikové koloně UC-Sil díky interakci karboxyl/amin se silanolovými skupinami.
• Metanol jako modifier poskytl ostřejší a symetričtější špičky než acetonitril; přidání 5 % vody zlepšilo separaci rychle elujících demethylovaných sloučenin.
• Nižší teplota kolony (20 °C) a tlak BPR 15 MPa zvýšily rozlišení (Rs až 2,0–2,3).
• Optimální průtok 2 mL/min zajistil rovnováhu mezi časem analýzy a výkonem separace.
• Směs organických modifierů (metanol/ethanol/voda 50/45/5) dále zlepšila selektivitu ve srovnání s čistým methanolem.
• Srovnání SFC a HPLC odhalilo odlišné eluační pořadí izomerů; SFC byla rychlejší a efektivnější pro tyto polární fluorofory.

Přínosy a praktické využití metody

Superkritická fluidní chromatografie nabízí nízkou viskozitu mobilní fáze, vyšší difuzivitu a možnost rychlejších analýz než běžné UHPLC či HPLC. Optimalizovaná metoda umožňuje spolehlivou separaci izomerů fluorescenčních sond, což přispívá k přesnějšímu kvantitativnímu i kvalitativnímu vyhodnocení v preklinických i klinických aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření stacionárních fází a modifikátorů pro ještě lepší selektivitu u širšího spektra fluoroforů.
• Přímé on-line spojení SFC s HRMS pro detailní fragmentační analýzu izomerů.
• Vývoj zelenějších modifikátorů a optimalizace spotřeby CO₂ pro udržitelnou chromatografii.
• Implementace metody do automatizovaných high-throughput platforem pro screening biomarkerů.

Závěr

Studie prokázala, že metodika SFC na silikové koloně s vhodně zvoleným modifierem, teplotou a tlakem umožňuje vysoce efektivní separaci izomerů karboxytetramethylrhodaminu. Návrh optimalizace parametrů poskytuje robustní analytický postup aplikovatelný v biomedicínských laboratořích.

Reference

• Kamiya M., Urano Y. Precise Design of Fluorescent Probe to Provide Biological Functional Imaging. DOJIN NEWS, No. 138, 2011.