Identification of Small Molecules via Real-Time Library Search on an Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Real-time library search (RTLS) v hmotnostní spektrometrii otevírá nové možnosti pro okamžitou identifikaci malých molekul během datové akvizice. Díky této technologii lze dynamicky řídit průběh experimentu na základě kvality a relevance spektrálních uhodnutí. To přináší výrazné zefektivnění analýzy komplexních vzorků, minimalizaci falešně pozitivních signálů a lepší vyvážení mezi šířkou datového pokrytí a hloubkou získaných informací.

Cíle a přehled studie / článku

• Navrhnout a implementovat RTLS filtr do ovládacího softwaru Tune verze 3.5 pro Orbitrap Tribrid spektrometry.
• Ověřit schopnost provádět simultánní MS2 spektrální porovnání s mzim Vault (.db) a mzCloud offline knihovnami během akvizice.
• Demonstrace řízení sofistikovaných rozhodovacích stromů v metodách pro analýzu malých molekul.

Použitá metodika a instrumentace

Real-time library search využívá Windows službu napsanou v C#, která komunikuje s ovládacím softwarem Tune. K implementaci bylo použito:

• Orbitrap Fusion Eclipse Tribrid a Orbitrap IQ-X Tribrid hmotnostní spektrometry.
• Ovládací software Tune 3.5 s modifikovaným RTLS filtrem.
• Spektrální knihovny ve formátu mzVault (.db) a offline kopie mzCloud knihovny.
• Parametry vyhledávání zahrnují tolerance kolizní energie, tolerance prekurzoru, rozšíření na různé aduktové formy a maximální dobu hledání na sken.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace RTLS dovoluje:

• Generování kosinové podobnosti a důvěryhodnostního skóre pro každý MS2 sken.
• Okamžité rozhodování o dalším skenování (MSn, změna aktivace) na základě skóre a uživatelsky definovaných filtrů.
• Podporu více instancí RTLS filtru v rámci jedné metody, každá s individuálními parametry spouštění.
• Statistiku doby hledání v reálném čase (průměrné časy pro 15 130 skenů mezi 5–65 NCE při ±5 ppm).

Diskuse zdůrazňuje, že prediktivní fragmentace peptidů nelze aplikovat na malé molekuly, a proto RTLS spoléhá na empiricky získané spektra z knihoven.

Přínosy a praktické využití metody

Dynamické řízení akvizice vede k:

• Efektivnějšímu zaměření na analyty zájmu a potlačení rušivých signálů.
• Automatickému opakovanému vnášení nízkokoncentrovaných prekurzorů k vyčerpávajícímu vzorkování (automatic reinjection).
• Možnosti definovat knihovně řízené MSn metody pro cílené třídy látek s flexibilní prahovou logikou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace rozsáhlejších online knihoven a strojového učení pro zlepšení skórování.
• Propojení s post-akvizičními workflow (fragmentační stromy, návrh elementárních vzorců, pathway analýzy).
• Rozšíření RTLS na další třídy analytů, včetně neznámých sloučenin a metabolomiky.

Závěr

Real-time library search na platformách Orbitrap Tribrid přináší zásadní posun v akviziční logice pro malé molekuly. Umožňuje okamžité spektrální porovnání, řízení MSn metod a flexibilní filtrování na základě skóre z rozsáhlých knihoven. Technologie je dostupná v softwaru Tune verze 3.5 a otevírá cestu k vysoce účinným, adaptivním experimentům.

Reference

• Erickson BK, et al. Active Instrument Engagement Combined with a Real-Time Database Search for Improved Performance of Sample Multiplexing Workflows. J Proteome Res. 2019;18(3):1299–1306
• Eng JK, et al. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 2013;13(1):22–24
• Thermo Fisher Scientific. mzCloud Offline Spectral Library v2020B, formát mzVault .db