Deep Metaproteome Analysis using a Vanquish Neo UHPLC System Coupled to an Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer with FAIMS Pro Interface

Význam tématu

Metaproteomická analýza zajišťuje detailní charakterizaci proteinového složení komplexních biologických vzorků mikrobiálních komunit. Díky vysokému objemu dat a širokému dynamickému rozsahu proteinů je však třeba využít pokročilé chromatografické a spektrometrické techniky pro dosažení hlubokého pokrytí proteomu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo posoudit vliv připojení FAIMS Pro Interface k systému Vanquish Neo UHPLC spojenému s Orbitrap Eclipse Tribrid MS na pokrytí metaproteomu dvou standardizovaných vzorků mikrobiální komunity (ZymoBIOMICS Microbial Community Standard a Gut Microbiome Standard). Studie porovnává analýzu bez FAIMS a s celou sadou kompenzačních napětí (CV) pro optimalizaci počtu identifikovaných proteinů a peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly použity standardní protokoly lýzy, redukce, alkylace a digesce enzymy Lys-C a trypsinem. Separace 1 µg peptidů proběhla na systému:

• Vanquish Neo UHPLC
• EASY-Spray PepMap Neo kolona (2 µm C18, 75 µm × 75 cm)
• Gradient: 5–28 % a 28–40 % acetonitrilu v 120 min

Spektrometrie byla prováděna na:

• Orbitrap Eclipse Tribrid MS
• FAIMS Pro Interface s CV –35 V, –50 V a –65 V (3 s cyklus, top-speed)

Datové zpracování zahrnovalo Proteome Discoverer 3.0, SEQUEST HT a INFERYS rescoring.

Hlavní výsledky a diskuse

• Bez FAIMS identifikováno přes 10 000 proteinů a 70 000 peptidů; se FAIMS nárůst identifikací o přibližně 19 % (12 938 proteinů) a 17,5 % (13 332 proteinů).
• Minimální překryv peptidů mezi třemi CV ukázal efektivní frakcionaci vzorku v plynném stavu.
• Kvantitativní reprodukovatelnost: více než 93 % proteinů kvantifikováno s CV < 20 % ve trojité injekci.
• Label-free kvantifikace odpovídala relativním abundancím získaným z NGS, s výjimkou nízkých abundancí, kde NGS nadhodnocovalo.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace potřeby rozsáhlých offline frakcí zjednodušuje workflow.
• Zvýšené pokrytí proteomu umožňuje detailnější charakterizaci mikrobiálních komunit.
• Gas-fázová frakcionace pomocí FAIMS Pro Interface nevyžaduje dodatečnou manipulaci se vzorkem.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace kompenzačních napětí a cyklů pro různé typy vzorků.
• Integrace hlubokého učení pro zlepšení identifikačního výkonu (pokročilé rescoringové algoritmy).
• Rozšíření aplikací do environmentálních a klinických metaproteomických studií.

Závěr

Zapojení FAIMS Pro Interface k Vanquish Neo UHPLC a Orbitrap Eclipse Tribrid MS významně zvýšilo počet identifikovaných proteinů a peptidů v metaproteomických standardech. Metoda nabízí vysokou reprodukovatelnost a kvalitní kvantifikaci, což potvrzuje její přínos pro detailní analýzu mikrobiálních komunit.

Reference

1. Wilmes P. & Bond P. L. Metaproteomics: studying functional gene expression in microbial ecosystems. Trends Microbiol. 14, 92–97 (2006).
2. Verberkmoes N. C. et al. Shotgun metaproteomics of the human distal gut microbiota. ISME J. 3, 179–189 (2009).
3. Zolg D. P. et al. INFERYS rescoring: Boosting peptide identifications and scoring confidence of database search results. Rapid Commun. Mass Spectrom., Special Issue, May 2021.