Q-RAI Provides Rapid and Sensitive Data Independent Acquisition for Peptide Quantitation

Význam tématu

Data-independent acquisition (DIA) se stala klíčovou metodou v proteomice díky schopnosti shromažďovat fragmentační data pro všechny ionty bez ohledu na jejich intenzitu. Quadrupole Resolved All Ions (Q-RAI) představuje novou DIA strategii kombinující plné skenování MS1 a postupné širokopásmové fragmentace v režimu vysokého rozlišení, což zajišťuje vysokou citlivost a selektivitu. Sleduje kritické vlastnosti proteinových terapeutik, jako jsou oxidace a deamidace, označované jako CQA (Critical Quality Attributes).

Cíle a přehled studie / článku

Účelem práce bylo ověřit vhodnost Q-RAI pro kvantitativní analýzu peptidů s důrazem na nízkoúrovňové modifikace v modelovém vzorku NIST mAb. Autoři sledovali:

• Validaci kvality generovaných MS1 a MS/MS dat.
• Kvantifikaci úrovně oxidace a deamidace po nucené úpravě vzorku.
• Mapování sekvence peptidů s vysokým pokrytím (>95 %).

Použitá metodika a instrumentace

Sample Preparation:

• Redukce, alkylace a trypsinová digesce proteinů.
• Pro nucenou oxidaci inkubace s různými koncentracemi H2O2 (0–1 %).
• Pro nucenou deamidaci inkubace při pH 9 po dobu 0–14 dnů.

LC/Q-TOF podmínky:

• Kolona AdvanceBio Peptide Mapping (2.1 × 150 mm), 25min gradient.
• Spektrální knihovny sestavené v data-dependent módu.
• DIA v Q-RAI: 12 oken, šířka 100 amu s překrytím 1 amu, CE optimalizované podle m/z.
• MS1 rychlost 8 Hz, MS/MS v Q-RAI oknech 14 Hz.

Data processing:

• Spectrum Mill pro zpracování spektrálních knihoven.
• Skyline pro kvantifikaci, včetně mProphet scoringu.

Hlavní výsledky a diskuse

Validace kvality:

• MS1 a MS/MS data vykazují nízkou chybovost hmotnosti (<5 ppm).
• mProphet p- a q-hodnoty potvrzují konzistentní a spolehlivé identifikace.

Kvantifikace oxidace a deamidace:

• Oxidace methioninů sledována při různých hladinách H2O2, linearita odpovědi a proporcionalita fragmentů potvrzena.
• Deamidace peptidu VSNKALPAPIEK měřena při inkubaci při pH 9, výsledky odpovídají očekávaným kinetikám.
• Peptidová mapa prokázala >95% sekvenční pokrytí.

Přínosy a praktické využití metody

• Citlivá detekce nízkoúrovňových modifikací bez ztráty dat.
• Jednoduché spektrální rozlišení díky širokým DIA oknům.
• Možnost rychlého rozvoje kvalitativní a kvantitativní kontroly kvality proteinových terapeutik.
• Kompatibilita s existujícími platformami LC/Q-TOF a softwarovými nástroji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace oken Q-RAI na užší šířky pro ještě vyšší selektivitu.
• Integrace s vysokokapacitními proteomickými přístupy a umělou inteligencí pro automatizované zpracování dat.
• Rozšíření na další třídy modifikací (glykozylace, fosforylace).
• Využití v bioprocesním vývoji a regulované kontrole kvality GMP.

Závěr

Q-RAI představuje účinnou data-independent akviziční strategii pro kvantitativní analýzu peptidů s nízkou úrovní modifikací. Metoda nabízí vysokou kvalitu dat, spolehlivou kvantifikaci CQA a široké možnosti aplikace v oblasti proteinových terapeutik.

Reference

1. Pino LK, Searle BC, et al. Mass Spectrom. Rev. 2020;39(3):229–244.
2. Doerr A. Nat. Methods. 2015;12:35.
3. Reiter L, Rinner O, et al. Nat. Methods. 2011;8:430–435.