STANOVENÍ HLADINY ACETYLCHOLINU A CHOLINU V HIPPOKAMPU POTKANA KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ

Význam tématu

Rychlé a přesné stanovení acetylcholinu (ACh) a cholinu (Ch) v mozkové tkáni je klíčové pro hodnocení neurotoxických účinků organofosfátových látek a účinnosti protijedů. Expozice nervovým bojovým jedem, jako je soman, vede k akumulaci ACh na cholinergních synapsích a k akutní cholinergní krizi. Kvantifikace těchto sloučenin v hipokampu umožňuje objektivní posouzení terapie a predikci prognózy intoxikace.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout selektivní a citlivou metodu na bázi kapalinové chromatografie spojené s elektrochemickou detekcí a postkolonovým enzymatickým reaktorem pro současné stanovení ACh a Ch v hippokampu potkana. Metoda byla aplikována k porovnání schopnosti obidoximu a oximu HI-6 spolu s atropinem redukovat akumulaci ACh po subletální intoxikaci somanem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky hippocampu byly homogenizovány v 0,1 M kyselině chloristé s interním standardem (ethylhomocholin) a po centrifugaci filtrovány. Analýza probíhala na HPLC systému sestaveném z:

• Gradientové pumpy SpectraSERIES P200
• Vysokotlakého dávkovače Rheodyne 7125 (10 µl smyčka)
• Reverzní C18 kolony ESA ACH-3 (150×3 mm, 5 µm) při 35 °C
• Postkolonového enzymatického reaktoru s imobilizovanou acetylcholinesterázou a cholinoxidázou (ESA)
• Amperometrického detektoru Coulochem II (potenciál pracovní elektrody +500 mV)

Mobilní fáze: 100 mM hydrogenfosforečnan sodný, 2 mM natrium-oktylsulfonát, 0,005 % antimikrobiální činidlo, pH 8,0; průtok 0,35 ml/min. Metoda poskytla lineární odezvu v rozmezí 0,15–30 ng/10 µl (r>0,998), detekční limit 0,15 ng/10 µl a obnovu >90 %.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Kontrolní koncentrace ACh v hipokampu byly stabilní.
2. Soman způsobil významné zvýšení ACh po 1 a 24 hodinách (P<0,01).
3. Kombinace HI-6 a atropinu normalizovala hladinu ACh v obou časových bodech.
4. Obidoxim s atropinem eliminoval akumulaci ACh až po 24 hodinách, ale v akutní fázi (1 h) vedl k ještě výraznější akumulaci (P<0,001).
Výsledky ukazují, že HI-6 proniká přes hemato-encefalickou bariéru a je účinným oximem proti centrálním účinkům somanu, zatímco obidoxim v akutní fázi není adekvátní a může hyperstimulaci cholinergního systému zhoršit.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje citlivé sledování ACh a Ch v mozkové tkáni.
• Slouží k hodnocení účinnosti protijedů proti organofosfátům.
• Vhodná pro toxikologický výzkum, farmakologii a QA/QC při vývoji antidot.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další neurochemické markery (neurotransmitery, metabolity).
• Integrace s in vivo mikrodialýzou pro kontinuální monitoring.
• Miniaturizace a multiplexní detekční systémy.
• Vyšší stupeň automatizace a on-line sample preparation.
• Potenciální aplikace v klinickém sledování pacientů s cholinergními poruchami.

Závěr

Vyvinutá metoda HPLC-EC s postkolonovým enzymatickým reaktorem je rychlá, citlivá a selektivní pro stanovení ACh a Ch v hipokampu potkana. Umožnila jasně prokázat vyšší terapeutickou účinnost oximu HI-6 oproti obidoximu při léčbě somanem vyvolané cholinergní krize. Metoda je cenným nástrojem pro hodnocení protijedů a neurotoxikologický výzkum.

Reference

1. Potter P. E., Meek J. L., Neff N. H.: J. Neurochem. 41, 188 (1983).
2. Damsma G., Westerink B. H. C., Horn A. S.: J. Neurochem. 45, 1649 (1985).
3. Ikarashi Y. et al.: J. Chromatogr. A 718, 267 (1995).
4. Yasumatsu M. et al.: Comp. Biochem. Physiol. A 121, 13 (1998).
5. Tsai T.-H.: J. Chromatogr. B 747, 111 (2000).
6. ESA Application note: Acetylcholine in Brain Microdialysates. ESA, Chelmsford 2000.
7. Marrs T. C.: Pharmacol. Ther. 58, 51 (1993).
8. Taylor P.: The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw Hill, New York 1996.
9. Dawson R. M.: J. Appl. Toxicol. 14, 317 (1994).
10. Kassa J., Cabal J.: Toxicology 132, 111 (1999).
11. Eckschlager K.: Chyby chemických rozborů. SNTL, Praha 1971.
12. Kassa J.: Toxicology 101, 167 (1995).
13. Clement J. G.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 112, 104 (1992).
14. Kassa J., Koupilová M.: Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 663 (2000).
15. Shih T.-M.: Arch. Toxicol. 67, 637 (1993).
16. van Helden H. P. M. et al.: Arch. Toxicol. 70, 779 (1996).