Identification of Multiple Sites of Intra-Molecular Protonation and Different Fragmentation Patterns within the Fluoroquinolone Class of Antibiotics in Porcine Muscle Extracts Using Travelling Wave Ion Mobility Mass Spectrometry

Význam tématu

Fluorochinolonová antibiotika jsou klíčová v veterinární medicíně, avšak jejich rezidua v potravinách vyžadují spolehlivou detekci vzhledem k riziku rezistence a přísným maximálním limitům stanoveným v EU. Kombinace kapalinové chromatografie s iontovou mobilitou a hmotnostní spektrometrií přináší další rozměr separace a identifikace, který zvyšuje citlivost, selektivitu a spolehlivost analýzy v komplexních biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo odhalit a charakterizovat více míst intra­molekulární protonace u fluorochinolonů v extraktech vepřového masa a prokázat rozdílné fragmentační vzorce jednotlivých protomerů pomocí technologie High Definition Mass Spectrometry ve vysokém rozlišení spojené s iontovou mobilitou.

Použitá metodika a instrumentace

- Příprava vzorků: fortifikace slepé vepřové svaloviny 25 antibiotiky, homogenizace, extrakce vodno-organickým činidlem, centrifugace a přímá injekce.
- UPLC: ACQUITY UPLC BEH C18 kolona 1,7 μm, 50×2,1 mm při 40 °C, gradient vody a acetonitrilu s 0,1 % kyselinou mravenčí, průtok 0,6 ml/min.
- Mass spectrometrie: SYNAPT G2-S, ESI pozitivní režim, HDMS E ve spojení s Traveling Wave iontovou mobilitou; drift gas N2 a CO2, napětí T-Wave 550 m/s, pulzní výška 40 V, rozsah m/z 50-1200, kolizní energie 15-45 eV.
- Software: MassLynx s modulem DriftScope pro vizualizaci mobilitních dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza odhalila, že fluorochinolony tvoří v plynném stavu dva protomery odlišné místem protonace na kyselé a zásadité skupině. Rozdíl drift time u ciprofloxacinu činil přibližně 1,14 ms. HDMS E umožnilo izolované fragmentační spektrum každého protomeru: fragmenty m/z 314 a 231 charakterizují kyselý protomer, zatímco m/z 288 a 245 zásaditý protomer. Při použití CO2 jako drift gasu došlo ke zvýšení separačního rozlišení (Rs až 4,13) oproti N2 (Rs pod 1,5). Orthogonální IMS separace rovněž efektivně oddělila signály analy­tů od složité matrice, což umožnilo produkovat čistá MS a MS E spektra bez nutnosti rozsáhlé připravy.

Přínosy a praktické využití metody

• Drift time jako nový identifikační bod vedle retenční doby a přesných hmotností fragmentů
• Zvýšená selektivita a citlivost při monitoringu reziduí antibiotik
• Omezení falešně pozitivních signálů v metodách MRM díky lepší separaci protomerů
• Možnost redukce až eliminace složité předúpravy vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

• Využití alternativních drift gasů s vyšší polarizovatelností pro další zlepšení rozlišení
• Integrace IMS databází drift time hodnot pro rutinní QA/QC v potravinářské chemii
• Rozšíření aplikace na další skupiny lékových reziduí a metabolitů
• Automatizace metod pro vysokou propustnost v reziduálním monitoringu

Závěr

HDMS E s iontovou mobilitou přidanou ke konvenční UPLC-MS přinesla jasné rozlišení a charakterizaci intra­molekulárních protomerů fluorochinolonů v komplexním biologickém extraktu. Metoda zvyšuje robustnost, selektivitu a spolehlivost reziduální analýzy antibiotik a přináší nový identifikační parametr pro rutinní kontroly.

Reference

1. USA FDA 2000 Final Decision Docket #2000N-1571.
2. FDA Center for Veterinary Medicine 1997.
3. EC Regulation 1831/2003.
4. EC L24/2006 Establishment of MRLs.
5. Verdon E et al. AOAC Int. 2005; 88:1179-1192.
6. Kaufmann A et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009; 23:985-998.
7. Mol HG et al. Anal Bioanal Chem. 2012; 403:2891-2908.
8. Croley TR et al. J Am Soc Mass Spectrom. 2012; 23:1569.
9. EC Decision 2002/657/EEC.
10. Lalli PM et al. J Mass Spectrom. 2012; 47:712-719.
11. Waters Technical Note 720003201en. 2009.
12. Jurneczko E et al. Anal Chem. 2012; 84:8524-8531.
13. Asbury GR, Hill HH. Anal Chem. 2000; 72:580-584.
14. Fasciotti M et al. J Mass Spectrom. 2012; 47:1643-1647.