Introducing Atlantis BEH Z-HILIC: A Zwitterionic Stationary Phase Based on Hybrid Organic/Inorganic Particles

Význam tématu

HILIC (hydrophilic interaction chromatography) je klíčová technika pro separaci velmi polárních sloučenin, které nelze efektivně analyzovat běžnými reverzními fázemi. Zwitteriontové stacionární fáze se sulfobetaine skupinami nabízejí unikátní vlastnosti díky rovnováze záporných a kladných nábojů na povrchu částic, což minimalizuje iontově výměnnou interakci a současně zajišťuje silnou retenci polaritních molekul. Atlantis Premier BEH Z-HILIC rozšiřuje aplikovatelné pH na 2–10 a zvyšuje účinnost oproti polymerním fázím, což přináší větší flexibilitu v analytických metodách.

Cíle a přehled studie

Studie prezentuje novou zwitteriontovou stacionární fázi založenou na ethylenem propojených hybridních (BEH) organicko/anorganických částicích. Cílem bylo porovnat její retenční a selektivní vlastnosti, účinnost, reprodukovatelnost mezi výrobními šaržemi a chemickou stabilitu v širokém pH rozsahu. Dále byla ověřena výkonnost pro citlivé analyty náchylné k adsorpci na kovové povrchy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro ověření charakteristik BEH Z-HILIC byly provedeny následující testy:

• Účinnost vs. průtok: ACQUITY UPLC I-Class s TUV detektorem (254 nm), kolona Atlantis Premier BEH Z-HILIC 1,7 µm, 2,1 × 50 mm.
• Retence a selektivita: ACQUITY UPLC H-Class s PDA detektorem (254 nm), srovnání BEH Z-HILIC, BEH Amide a BEH HILIC.
• Reprodukovatelnost: ACQUITY UPLC s TUV, 17 šarží BEH Z-HILIC, měření RSD retenčních faktorů.
• pH stabilita: Zrychlené testy při 70 °C v pH 11 (ammonium bicarbonate) a pH 2 (ammonium formate), sledování změn účinnosti a retence.
• Analýza kovově citlivých nukleotidů: ACQUITY Premier BSM s PDA (260 nm) a hardware MaxPeak High Performance Surfaces pro minimalizaci adsorpce na kov.
• Software: Empower 3 FR4 pro řízení a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Účinnost a retence: BEH Z-HILIC dosahuje až 12 100 USP desek pro cytosin při plochách částic 1,7 µm a redukované výšce 2,4, srovnatelně s BEH HILIC a BEH Amide.
2. Selektivita: Nejvyšší retenční faktory pro neutrální polarové prototypy (uridin), výrazné odlišení methylenových a hydroxylových skupin, konfigurace a regioisomerů, i měření kationtové a aniontové selektivity.
3. Reprodukovatelnost: RSD retenčního faktoru thyminu 2,0 % a relativní retence ostatních analytů 0,7–2,2 % napříč 17 šaržemi, úroveň nejlepších C18 kolón.
4. pH stabilita: Po 34 h expozice pH 11 při 70 °C pokles účinnosti pouze o 5,8 %, změna retence 2,5–5,0 %. V kyselém prostředí pH 2 po 9 h méně než 1 % změna retence.
5. Kovově citlivé analyty: S hardwarem MaxPeak HPS se AMP, ADP a ATP zobrazily jako symetrické špičky, oproti roztaženým a odpadajícím signálům na standardním modulu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké sloupcové účinnosti a silná retence neutrálních polárních látek
• Komplementární selektivita k BEH Amide a BEH HILIC fázím
• Široký pH rozsah (2–10) pro flexibilní metodický vývoj
• Vynikající reprodukovatelnost mezi výrobními šaržemi
• Minimalizace kovové adsorpce vhodná pro nukleotidy, fosfáty a polykarboxyláty
• Aplikace v metabolomice, analýze kultivačních médií, farmaceutické a potravinářské kvalitě

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj hybridních částic s vyššími povrchovými plochami pro zvýšení retence
• Integrace s pokročilými UPLC systémy s nízkoadsorpčními povrchy
• Kombinace HILIC s tandemovou hmotnostní spektrometrií pro komplexní metabolomické a proteomické studie
• Nasazení v automatizovaných pracovních postupech pro výzkum a QA/QC v širokém pH rozsahu

Závěr

Atlantis Premier BEH Z-HILIC představuje univerzální a vysoce výkonnou zwitteriontovou HILIC fázi založenou na BEH částicích. Její kombinace vysoké účinnosti, širokého pH rozsahu, vynikající selektivity a stabilního výkonu pro kovově citlivé analyty z ní činí preferovanou volbu pro moderní analytické laboratorní aplikace.

Reference

• Alpert A. J. Hydrophilic Interaction Chromatography for the Separation of Peptides, Nucleic Acids and Other Polar Compounds. J. Chromatogr. 1990, 499, 177–196.
• Hemström P.; Irgum K. Hydrophilic Interaction Chromatography. J. Sep. Sci. 2006, 29, 1784–1821.
• Jandera P. Stationary and Mobile Phases in Hydrophilic Interaction Chromatography: A Review. Anal. Chim. Acta 2011, 692, 1–25.
• Guo Y.; Gaiki S. Retention and Selectivity of Stationary Phases for Hydrophilic Interaction Chromatography. J. Chromatogr. A 2011, 1218, 5920–5938.
• Jiang W.; Irgum K. Covalently Bonded Polymeric Zwitterionic Stationary Phase for Simultaneous Separation of Inorganic Cations and Anions. Anal. Chem. 1999, 71, 333–344.
• Dinh N. P.; Jonsson T.; Irgum K. Water Uptake on Polar Stationary Phases Under Conditions for Hydrophilic Interaction Chromatography and Its Relation to Solute Retention. J. Chromatogr. A 2013, 1320, 33–47.
• Soukup J.; Jandera P. Adsorption of Water from Aqueous Acetonitrile on Silica-Based Stationary Phases in Aqueous Normal-Phase Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A 2014, 1374, 102–111.
• Trivedi D. K.; Jones H.; Shah A.; Iles R. K. Development of ZIC HILIC-MS Metabolomics Method for Shotgun Analysis of Human Urine. J. Chromat. Separation Techniq. 2012, 3, 144–155.
• Floris P. et al. A LC-MS/MS Platform for the Identification of Productivity Markers in Industrial Mammalian Cell Culture Media. Process Biochemistry 2019, 86, 136–143.
• Hmelnickis J. et al. Application of Hydrophilic Interaction Chromatography for Simultaneous Separation of Six Impurities of Mildronate Substance. J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 48, 649–656.
• Diez C. et al. Aminoglycoside Analysis in Food of Animal Origin with a Zwitterionic Stationary Phase and LC-MS/MS. Anal. Chim. Acta 2015, 882, 127–139.
• Ikegami T. et al. Separation Efficiencies in Hydrophilic Interaction Chromatography. J. Chromatogr. A 2008, 1184, 474–503.
• Wyndham K. D. et al. Characterization of C18 Stationary Phases Based on Ethyl-Bridged Hybrid Particles. Anal. Chem. 2003, 75, 6781–6788.
• Mazzeo J. R. et al. Advancing LC Performance with Smaller Particles and Higher Pressure. Anal. Chem. 2005, 77, 460A–467A.
• Lauber M. et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper 2020.
• Grumbach E. S. et al. Application of Novel 1.7 µm Ethylene Bridged Hybrid Particles for HILIC. J. Sep. Sci. 2008, 31, 1511–1518.
• Heaton J. C.; McCalley D. V. Kinetic Performance of sub-2 µm Core-Shell, Hybrid and Conventional Bare Silica Phases in HILIC. J. Chromatogr. A 2014, 1371, 106–116.
• Kawachi Y. et al. Chromatographic Characterization of HILIC Stationary Phases. J. Chromatogr. A 2011, 1218, 5903–5919.
• Neue U. D. et al. Assessment of Reproducibility of Silica-Based Reversed-Phase Packings. J. Chromatogr. A 1999, 849, 87–100.
• Berthelette K.; Walter T. Stability of HILIC Stationary Phases Under Low and High pH. HPLC 2019.
• DeLano M. et al. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal. Chem. 2021, 93(14), 5773–5781.
• Walter T. H. et al. Low Adsorption UPLC Systems and Columns Based on MaxPeak HPS: The ACQUITY Premier Solution. Waters White Paper 2021.