HIGH PERFORMANCE THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (HPTLC) OF ECDYSTEROIDS PRESENT IN PLANT EXTRACTS COUPLED WITH IN SITU ANALYSIS AND IMAGING DESI/IMS/MS

Význam tématu

Analýza fytoecdysteroidů v rostlinných extraktech představuje klíč k objevu biologicky aktivních sloučenin s potenciálem v agrikultuře i farmakologii. Ecdysteroidy, jako polyhydroxylované steroidy, ovlivňují růst a vývoj členovců a vykazují anabolické účinky u savců. Pro efektivní screening komplexních rostlinných směsí je nezbytná kombinace spolehlivých separačních a detekčních technik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo demonstrovat využití vysokovýkonné tenkovrstvé chromatografie (HPTLC) spojené s imagingovou a iontovou mobilitou podporovanou deskovou desorpční elektrosprayovou ionizací (DESI IMS/MS) pro selektivní identifikaci a rozlišení ecdysteroidních izomerů ve výchozích rostlinných extraktech z různých druhů Silene.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Separaci extraktů z pěti methanolických výtažků rostlin Silene fimbriata, S. nutans, S. viridiflora na HPTLC deskách se silikagelovou vrstvou.
• Vývoj dělicího systému chloroform:ethanol (4:1 v/v) a kontrolu separace pomocí UV lampy (λ=254 nm).
• On-plate analýzu jednotlivých skvrn technikou DESI IMS/MS s cílem zobrazit i mobilně oddělené izomery.

Použitá instrumentace

• HPTLC desky 5×7,5 cm (hliníkové podložky) a 10×10 cm (skleněné podložky) se silikagelovým povrchem.
• Vývojová komora s chloroform:ethanol 4:1.
• DESI 2D stage od Prosolia a SYNAPT XS High Definition MS (Waters Corporation).
• Nastavení IMS: pozitivní ionizace, rozsah m/z 100–1200, driftová vlna 1000→250 m/s.
• Softwarové nástroje: MassLynx 4.2, DriftScope 2.9, High Definition Imaging 1.5.

Hlavní výsledky a diskuse

Standardy ecdysteroidů (ponasteron A, ecdysone, kaladasteron, inokosteron, 20-hydroxyecdysone) byly separovány jak TLC (Rf od 0,25 do 0,55), tak v IMS (Dt od 5,1 do 5,43 ms). U molekul isobarických pár ecdysone/ponasterone A došlo k separaci oběma dimenzemi, zatímco inokosteron a 20-hydroxyecdysone sdílely shodné Rf a podobné Dt. Ve vzorcích S. fimbriata byl nejintenzivnější signál m/z 503,29 (Rf 0,28), putativně odpovídající inokosteronu/20-hydroxyecdysone, a tři oddělené skvrny pro m/z 519,29 (Rf 0,09; 0,23; 0,39), z nichž jedna odpovídala polypodinu B (Dt 5,43 ms). Izozměny byly rozlišeny díky třem vrcholům Dt 4,7; 5,23; 5,43 ms. U dvou vzorků S. nutans se prokázalo osm odlišných TLC skvrn se sdílenými mobilními charakteristikami.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlý screening komplexních rostlinných extraktů bez nutnosti rozsáhlé předúpravy.
• Současné zobrazení UV aktivních sloučenin a podpora selektivního výběru pro další hmotnostní analýzu.
• Zvýšenou schopnost detekce díky imagingu a rozlišení izomerů pomocí iontové mobility.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace HPTLC s DESI IMS/MS se jeví jako perspektivní přístup nejen pro ecdysteroidy, ale i pro jiné polární metabolity v rostlinných a biologických matricích. Další vývoj by mohl zahrnovat kvantitativní vyhodnocení, automatizované vyhledávání vzorů a rozšíření databází driftových časů pro rychlejší identifikaci.

Závěr

Kombinace HPTLC a DESI IMS/MS představuje robustní platformu pro selektivní detekci a rozlišení fytoecdysteroidů. Metoda umožňuje efektivní screening a charakterizaci izomerů, čímž rozšiřuje analytické možnosti v oblasti přírodních produktů.

Reference

• Ecdysteroids database (ecdybase.org)