Quantitative Analysis of Polysorbate 20/80 in Protein-Based Biopharmaceuticals Using A One-Pot RPLC-MS Based Platform Method

Význam tématu

Polysorbate 20 a 80 se běžně používají jako surfaktanty v biopharmaceutických přípravcích ke snížení denaturace, agregace a adsorpčních ztrát proteinů. Jejich degradace oxidačními, hydrolytickými procesy či enzymatickou aktivitou může vést k tvorbě částic, snížení účinnosti a riziku pro pacienty. Spolehlivá kvantifikace a charakterizace těchto excipientů je proto nezbytná pro zajištění stability, účinnosti a bezpečnosti léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout rychlou a vysoko propustnou platformní metodu založenou na RPLC-MS pro kvantifikaci polysorbate 20/80 v proteinových soluích. Metoda kombinuje jednoduchou přípravu vzorku v jednom kroku (hydrolýza a následná methylace) s chromatografickou separací a hmotnostní detekcí umožňující sub-ppm citlivost i vysokou specifičnost. Studie demonstruje její škálovatelnost a nasaditelnost v prostředí formulace, vývoje i QC laboratorí.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation probíhá v jednom kroku:

• Base hydrolyza ve 0,5 M NaOH při 65 °C po dobu 18 hodin k rozštěpení esterové vazby
• Methylace volných mastných kyselin v metanolu s 8 % HCl při 100 °C po dobu 1 hodiny
• Liquid-liquid extrakce hexanem k izolaci mastných kyselin ve formě methylesterů

Instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System
• Kolona ACQUITY UPLC BEH C8, 1,7 μm, 2,1×100 mm při 30 °C
• Mobile phase voda + 0,1 % FA a acetonitril + 0,1 % FA, gradientní eluce
• Detektor ACQUITY QDa Mass Detector v pozitivním ionizačním režimu se SIR akvizicí m/z pro cílové methylestery
• Data systém Empower 3 FR4

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografické optimalizace prokázaly, že C8 kolona zajistí dostatečnou retenci a rozlišení dominantních methylesterů bez koeluce. Hydrolytická studie ukázala, že k dosažení >95% konverze je potřebné 15–18 hodin. Zavedení saturogramatické methylace zvýšilo MS-signál až 10× díky snížené ztrátě vody in-source a vyšší protonové afinitě. Extrakční studie potvrdily >99% recoverií methylesterů v prvním extraktu a minimální carry-over. Aplikace metody na reálné vzorky se školkum umožnila stanovit 152 ± 2 ppm polysorbate 20 a 242 ± 6 ppm polysorbate 80 s výbornou linearitou a reprodukovatelností, přičemž celková citlivost dosahuje sub-ppm úrovně.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální platforma pro PS-20 i PS-80 s jednoetapovou přípravou vzorku
• Vysoká citlivost a specifičnost díky detekci methylesterů metodou RPLC-MS
• Vysoká propustnost (run < 10 minut) a snadná přenositelnost do QC laboratorí
• Škálovatelnost a flexibilita objemu vzorku dle potřeby koncentrace analyzovaných excipientů

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry vývoje mohou být:

• Automatizace přípravy vzorku v 96-jámkové formě pro vyšší throughput
• Rozšíření metody o další excipienty či jejich degradační produkty
• Implementace do online kontrol kvality v kontinuálních výrobních procesech
• Vývoj multimodálních detekčních režimů pro komplexní profilaci oleátových a laurátových derivátů

Závěr

Prezentovaná RPLC-MS platformní metoda s hydrolyzou a methylací v jednom kroku nabízí rychlou, citlivou a specifičtější alternativu k tradičním ELSD/CAD metodám pro kvantifikaci polysorbate 20/80. Jednoduchá příprava a flexibilita metody podporují její nasazení ve vývoji i rutinní kontrole kvality biopharmaceutik.

Reference

1. Kerwin B. Polysorbate 20 and 80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics Structure and Degradation Pathways. Journal of Pharmaceutical Sciences 2007 97(8) 2924–2935
2. Honemann M et al. Monitoring polysorbate hydrolysis in biopharmaceuticals using a QC-ready free fatty acid quantification method. Journal of Chromatography B 2019 1116 1–8
3. Labrenz S. Ester Hydrolysis of Polysorbate 80 in mAb Drug Product Evidence in Support of the Hypothesized Risk After the Observation of Visible Particulate in mAb Formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 2014 103 2268–2277
4. Hewitt D et al. Quantitation of polysorbate 20 in protein solutions using mixed-mode chromatography and evaporative light scattering detection. Journal of Chromatography A 2008 1215 156–160
5. Ilko D et al. Fatty acid composition analysis in polysorbate 80 with high performance liquid chromatography coupled to charged aerosol detection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2015 94 569–574
6. Birdsall R, Yu Y. An Efficient UV-Based Method for the Assessment of Oleic Acid Content in Biotherapeutic Drug Products Containing Polysorbate-80. Waters Application Note 720006129EN 2018
7. Ichihara K, Fukubayashi Y. Preparation of fatty acid methyl esters for gas-liquid chromatography. Journal of Lipid Research 2009 50 635–640