Analysis of Organic Acids in Culture Medium Using Post-Column pH Buffering Organic Acid Analysis System

Význam tématu

Analýza organických kyselin v kultivačním médiu je zásadní pro pochopení metabolických pochodů mikrobiálních buněk a optimalizaci bioprodukčních procesů. Sledováním koncentrací kyselin jako pyruvátu, mléčné, octové, mravenčí či sukcinové lze mapovat tok uhlíku, odhalovat úzká místa metabolismu a cíleně upravovat genetické modifikace za účelem zvýšení výtěžnosti cenných produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Článek demonstruje aplikaci iontově vylučovací chromatografie spojené s post-column úpravou pH a vodivostní detekcí ve dvojitém termostatovaném systému kolony. Cílem je zlepšit separaci organických kyselin v komplikovaných matricích kultivačního média a dosáhnout vyšší citlivosti měření při minimálním rušení pozadím.

Použitá metodika a instrumentace

Po chromatografickém rozdělení na dvou sériově propojených kolonkách Shim-pack SCR-102H (300 mm × 8,0 mm I.D., 7 μm) je eluát smíchán s pufrovacím roztokem obsahujícím p-Toluensulfonovou kyselinu, Bis-Tris a EDTA. Tím se upraví pH mobilní fáze téměř na neutrální, čímž se zvýší disociace kyselin a vodivostní signál.

Použitá instrumentace

• Iontově vylučovací chromatografický systém Shimadzu LC-20
• Sloupce Shim-pack SCR-102H v sérii (2 × 300 mm × 8,0 mm, 7 μm)
• Mobilní fáze: 5 mmol/L p-Toluensulfonová kyselina
• Post-column pufr: 5 mmol/L p-Toluensulfonová kyselina, 20 mmol/L Bis-Tris, 0,1 mmol/L EDTA·4H
• Průtok mobilní fáze a pufru: 0,8 mL/min
• Teplota kolony: 48 °C (hlavní), 25 °C (post-column)
• Detekce: vodivostní detektor

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání UV a vodivostní detekce ukázalo, že UV signál vykazuje nerovnoměrné intenzity píků vzhledem k rozdílům absorpčních koeficientů a je náchylný k interferencím z matric. Post-column pufrovaná vodivostní detekce poskytla vyrovnané píků signály a výrazně snížila šum z mobilní fáze. V kultivačním médiu byly všechny cílové kyseliny jasně separovány bez rušivých příměsí.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost a selektivita při analýze komplexních vzorků
• Jednodušší kvantifikace díky rovnoměrným signálům píků
• Možnost detailního sledování metabolických změn v reálném čase
• Vhodné pro výzkum, vývoj i QA/QC v biotechnologickém průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry jsou miniaturizace systému pro vyšší propustnost, integrace s on-line vzorkovači a rozvoj nových pufrů umožňujících analýzu širšího spektra organických sloučenin. Kombinace s hmotnostní detekcí může dále rozšířit rozsah aplikací a zlepšit kvalifikaci analyzovaných metabolitů.

Závěr

Použití post-column pH buffering vodivostní detekce ve dvojitém sloupcovém systému výrazně zlepšilo separaci a kvantifikaci organických kyselin v kultivačním médiu oproti tradiční UV detekci. Metoda nabízí robustní a citlivý nástroj pro sledování metabolických procesů a optimalizaci bioprodukčních postupů.