Determination of Eight Estrogens in Milk by UHPLC and the Agilent 6495 Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza estrogenních hormonů v mléce je klíčová pro ochranu veřejného zdraví vzhledem k rizikům souvisejícím s předčasnou pubertou, hormonálně závislými nádory a dalším nepříznivým vlivům na endokrinní systém. Regulace maximálních povolených hladin vyžaduje spolehlivé, citlivé a reprodukovatelné metody měření, které umožňují detekovat estrogenské sloučeniny pod hranicí 1 μg/kg.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou a přesnou metodu stanovení osmi klíčových estrogenů v kravském mléce pomocí UHPLC spojené s trojčtvrttý kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem Agilent 6495. Pro zjednodušení přípravy vzorku byla využita technika QuEChERS bez nutnosti chemické derivatizace. Metodika byla optimalizována tak, aby dosáhla kvantifikačních konstant pod požadovanou legislativní mezí.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Vážená 10g porce 2% mléka byla obohacena standardy estrogenů.
• Extrahováno 10 mL acetonitrilu, přidána extrakční směs QuEChERS, protřepání a odstředění.
• 6 mL organické fáze bylo očištěno disperzní SPE (15 mL QuEChERS), protřepáno, odstředěno a 4 mL sušeno pod dusíkem.
• Vzorek byl rekonstituován do 2 mL 50% methanol–voda, filtr a analýza UHPLC–MS/MS.

Instrumentace:

• UHPLC Agilent 1290 Infinity s kolonkou Poroshell 120 Phenyl-Hexyl 2,1×100 mm, 2,7 μm, teplota 35 °C.
• Mobilní fáze: voda s 0,4 mM NH4F (A) a směs methanolu/acetonitrilu 1:1 (B), průtok 0,4 mL/min, gradient 15–95 % složky B.
• MS Agilent 6495 Triple Quadrupole s ionizací JetStream ESI v negativním módu, režim dynamického MRM.
• Software: MassHunter Data Acquisition a Quantitative Analysis.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou citlivost a linearitu:

• IDL (instrumentální detekční mez) 1,2–3,7 ppt, LLOQ 5–10 ppt.
• Lineární dynamický rozsah 0,1–10 μg/kg s koeficientem lineárního regresního vztahu R2 > 0,997.
• Průměrné recoverie 83–106 % ve sledovaných koncentracích 0,2, 1 a 5 μg/kg, RSD < 10 %.
• Minimální matriceový efekt, sledované chromatogramy ukázaly čisté píky při retenčních časech odpovídajících standardům.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup přináší několik výhod:

• Jednoduchá a rychlá příprava vzorků bez derivatizace.
• Snížená spotřeba rozpouštědel a generace odpadu oproti klasickým SPE či LLE.
• Vysoká citlivost pod legislativními limity pro monitoring kvality potravin.
• Vhodné pro rutinní analýzu v laboratořích QA/QC i výzkumných centrech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření a zdokonalení:

• Aplikace na sušené mléko, mléčné prášky a další potravinové matrice.
• Integrace automatizovaných a miniaturizovaných QuEChERS modulů pro vyšší propustnost.
• Možné využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie pro potvrzení struktur a screening neočekávaných metabolitů.
• Implementace pokročilých datových analýz a umělé inteligence pro rychlé zpracování výsledků.

Závěr

Vyvinutá UHPLC–MS/MS metoda s použitím QuEChERS přípravy nabízí citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení osmi estrogenů v mléce pod požadovanou legislativní mezí. Díky jednoduchému postupu a nízké spotřebě rozpouštědel je vhodná pro rutinní monitoring a kontrolu kvality mléčných produktů.

Reference

1. Maruyama K., Oshima T., Ohyama K. Pediatr. Int. 2010, 52, 33–38.
2. Candyce H. et al. J. Natl. Cancer Inst. 2013, 105, 1759–1760.
3. Qin L.Q. et al. Med. Hypotheses 2004, 62, 133–142.
4. GB/T 22992-2008, Čína.
5. 96/23/EC, Směrnice Rady EU.
6. Stubbing G., Bigwood T. Anal. Chim. Acta 2009, 637, 68–78.
7. Parra N.P., Taylor L. Agilent Techn. Overview 2014, 5991-4089EN.