HPLC Carbohydrate Column Selection Guide

Význam tématu

Analýza sacharidů je náročná vzhledem k jejich podobným chemickým a fyzikálním vlastnostem. Přesné stanovení monosacharidů, disacharidů a oligosacharidů je klíčové zejména v potravinářství, biotechnologiích a farmaceutickém průmyslu pro kontrolu kvality a sledování výrobních procesů.

Cíle a přehled článku

Tento průvodce poskytuje výběr HPLC kolon SUPELCOGEL (resinové) a SUPELCOSIL (silikaové aminopropylové) optimalizovaných pro separaci různých tříd sacharidů. Shrnuje jejich výhody, omezení, typické provozní podmínky a aplikační oblasti.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: Kapalinová chromatografie s izokratickou elucí.
Detektory: refraktometrický index (RI) pro univerzální detekci sacharidů; UV (190–210 nm) pro organické kyseliny.
Kolonové náplně:

• SUPELCOSIL LC-NH2: aminopropyl silika, 25×4,6 mm, 5 µm, mobile fáze 75% acetonitril/voda.
• SUPELCOGEL Ca, Pb, K, C-610H, H, C-611, Ag1, Ag2: styren-divinylbenzenové pryskyřice ve formě Ca2+, Pb2+, K+, H+, Ag+; mobile fáze voda, 0,1% H3PO4, 10−4 N NaOH.

Provozní parametry: teploty 30–90 °C, průtoky 0,17–2,0 mL/min, pH 1–13. Doporučeno použití ochranných Supelguard kolon pro prodloužení životnosti analytických kolon.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání eluce na různých kolonách ukázalo:

• Na SUPELCOSIL LC-NH2 eluce vzrůstající molekulové hmotnosti (monosacharidy jako první), bez nutnosti derivatizace.
• Na SUPELCOGEL pryskyřicích eluce klesající velikostí (polysacharidy první, monosacharidy poslední) s kombinací velikostní exkluze a iontové výměny.
• SUPELCOGEL Ca exceluje v separaci monosacharidů a polyolů ve vodě při 80 °C.
• C-611 (Sr2+/Ba2+) poskytuje nejlepší rozlišení disacharidů a je teplotně citlivá.
• Ag1/Ag2 kolony určené pro oligosacharidy až do DP7 resp. DP12 užitečné pro piva a kukuřičné sirupy.
• C-610H a H kolonové náplně v H+ formě vhodné pro organické kyseliny, alkoholy i sacharidy v jednom běhu.

Praktické ukázky zahrnují analýzy piva, ovocného jogurtu, kukuřičných sirupů a směsi standardů, demonstrující selektivitu a rozlišení jednotlivých kolon.

Přínosy a praktické využití metody

• Široká škála separačních mechanismů pro různé skupiny sacharidů.
• Univerzální detekce RI bez nutnosti chemických derivatů.
• Rychlé a reprodukovatelné analýzy potravin, nápojů, bioprocesů.
• Minimální příprava vzorku (ředění, filtrace).
• Možnost oddělit cukerné a kyselé složky ve smíšených matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se vývoj kolon s menšími částicemi pro vyšší účinnost, integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální identifikaci, automatizace vzorkování a miniaturizace tzv. UHPLC verzí. Dále rozšiřování aplikací na potravinové alergeny a glykomiku.

Závěr

Pro optimální analýzu sacharidů je třeba zvolit kolonovou náplň odpovídající velikosti a třídě sacharidů, přičemž je důležité řídít se doporučenými provozními podmínkami a používat ochranné guard kolony. Přiložená tabulka časů retence nabízí vodítko k výběru.

Reference

• Knight, P. Biotechnology, 7: 35 (1989).
• Parriot, D. A Practical Guide to HPLC Detection, Academic Press (1992).
• Lehniger, A. Biochemistry, Worth Publishers (1975).
• Nollet, L. Food Analysis by HPLC, Marcel Dekker (1992).
• Supelco Bulletin 887B: HPLC Carbohydrate Column Selection Guide (2004).