Analysis of Doping Agents by UPC2-MS/MS

Význam tématu

Analýza dopingových agens je kritická pro dodržování pravidel sportovní integrity a ochranu zdraví sportovců. Vzhledem k chemické rozmanitosti zakázaných látek, od vysoce polárních metabolitů až po lipofilní stimulanty a steroidy, je nutné využít chromatografické techniky s odlišnou selektivitou. Ultra vysokotlaká superkritická tekutá chromatografie v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (UPC2-MS/MS) poskytuje ortogonální separaci vůči klasické GC-MS a LC-MS, čímž rozšiřuje schopnost identifikace látek obtížně polárních nebo špatně retinujících se na tradičních fázích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit robustní UPC2-MS/MS metodu pro simultánní detekci různých tříd zakázaných látek dle WADA MRPL (Minimum Required Performance Levels). První fáze zahrnovala screening čtyř stacionárních fází a modifikátorů mobilní fáze za účelem optimalizace retence a tvaru píků pro osm reprezentativních sloučenin. Druhá fáze rozšířila panel na desítky agens a validovala metodu na 1000 anonymizovaných vzorcích moči.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá jednoduchou přípravu "dilute and inject": 200 µl moče se ředí 790 µl acetonitrilu a 10 µl interního standardu, centrifuguje a 2 µl supernatantu je injektováno přímo. Separace probíhá na UPC2 systému s Torus Diol (OH) kolonou (3,0×100 mm, 1,7 µm, 130 Å) při 35 °C a průtoku CO2 s methanolem (0,1 % silné amoniakální báze) 1,2 ml/min. Detekce je realizována na Xevo TQ-XS v ESI+ a ESI– režimu.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace prokázala, že nejlepších výsledků bylo dosaženo na Torus Diol koloně s 0,1 % silné amoniakální báze v mobilní fázi B, což zabezpečilo:

• Dobrou retenci a symetrický tvar píků pro vysoce polární analyty (meldonium, etylglukuronid, amilorid).
• Stabilní retenční časy napříč 23 dávkami (RSD < 0,6 %).
• Selektivitu pro širší spektrum chemotypů, včetně stimulantů, steroidů, glukokortikoidů, diuretik a beta-blokátorů.

Screening 1000 autentických vzorků odhalil žádné falešné nálezy a potvrdil například stabilní dvojité píky fentanylu a drobné ucpání u některých sulfátovaných steroidů, avšak bez ovlivnění identifikace dle WADA kritérií.

Přínosy a praktické využití metody

• Ortogonální separace jako doplněk k LC-MS a GC-MS pro kompletní krytí chemického prostoru.
• Schopnost spolehlivě analyzovat polární a málo retinující látky bez nutnosti derivatizace.
• Rychlá příprava vzorku a vysoká propustnost laboratoře pro rutinní antidopingové testy.
• Citlivost vyhovující WADA MRPL pro všechny sledované látky, včetně detekce některých při 50 % MRPL.

Budoucí trendy a možnosti využití

UPC2-MS/MS se jeví jako perspektivní technologie pro:

• Rozšíření panelu detekce o nové dopingové látky, včetně glykosidů, konjugátů a vysoce toxických metabolitů.
• Integraci s vysokorozlišovacími hmotovými spektrometry pro neznámé screeningy.
• Automatizaci přípravy vzorku a on-line frakcionaci píků pro následnou confirmaci.
• Mezilaboratorní validace a standardizaci protokolů s cílem zlepšit interoperabilitu a důvěru výsledků.

Závěr

Vyvinutá UPC2-MS/MS metoda na Torus Diol koloně s modifikátorem 0,1 % silné amoniakální báze prokázala vysokou odolnost, reprodukovatelnost a citlivost potřebnou pro rutinní antidopingové analýzy. Metoda efektivně rozšiřuje chromatografický prostor nad rámec standardního LC-MS a GC-MS a nabízí spolehlivou ortogonální alternativu pro složité a polární látky.

Reference

1. World Anti-Doping Agency. The 2021 Prohibited List. Montreal, 2021.
2. World Anti-Doping Agency. TD2019MRPL. Minimum Required Performance Levels for Identification of Non-Threshold Substances. Montreal, 2019.
3. World Anti-Doping Agency. TD2015IDCR. Minimum Criteria for Chromatographic-Mass Spectrometric Confirmation of the Identity of Analytes for Doping Control Purposes. Montreal, 2015.
4. Nováková L. et al. Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry for Screening of Doping Agents. Analytica Chimica Acta, 853, 647–659, 2015.
5. Losacco G. et al. Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry for Antidoping Analyses: Assessment of the Inter-Laboratory Reproducibility with Urine Samples. Analytical Science Advances, 2020.